棉花GhCOMT1基因原核表达载体构建及蛋白纯化和Western鉴定
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国家自然科学基金-新疆联合基金项目(U1178305);新疆自治区高技术研究发展计划项目(201111116);国家自然科学基金项目(31060173)


Construction of Prokaryotic Expression Vector,Protein Purification and Identification of GhCOMT1 Gene from Gossypium hirsutum L.
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    摘要:

    为进一步研究GhCOMT1基因的功能,构建了原核表达载体pET-28a-GhCOMT1,酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在0.2 mmol/L IPTG浓度条件下分别进行不同温度梯度诱导,用蛋白标记亲和层析柱(His TrapTM HP)对重组蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。结果表明:16℃诱导12 h、30℃诱导3 h和37℃诱导3 h后融合蛋白均以包涵体的形式表达,其中16℃诱导12 h的蛋白表达量最大;SDS-PAGE检测目的蛋白相对分子量约为39.748 kD;Western blotting分析表明,目的蛋白能与His多克隆抗体起特异性反应。

    Abstract:

    To investigate the function of the GhCOMT1 gene,the GhCOMT1 gene was insert into the pET-28a vector to construct fusion vector pET-28a-GhCOMT1,and transformed into E.coli BL21 (DE3) cells.The fusion protein could be induced by 0.2 mmol/L IPTG treatment for 12 h at 16℃,for 3 h at 30℃ or 37℃,but the recombinant proteins mainly appeared as inclusion bodies.The most high expression quantity was induced at 16℃ for 12 h.Then to dissolved inclusion body,SDS-PAGE analysis indicated that its molecular mass is about 39.748 kD,Western blotting analysis indicated that the His polyclonal antibody could specifically bound to purified His-GhCOMT1 fusion protein.The prokaryotic expression system of pET-28a-GhCOMT1 is successfully constructed.It can be used to the further application study on function of GhCOMT1.

    参考文献
    相似文献
    引证文献
引用本文

李 波,倪志勇,李晓东,等.棉花GhCOMT1基因原核表达载体构建及蛋白纯化和Western鉴定[J].西北植物学报,2012,32(10):1971-1976

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