摘要
【目的】 揭示海菜花和波叶海菜花的传粉特性,阐明其影响成功传粉因素,为两者杂交育种提供理论和技术指导。【方法】以海菜花和波叶海菜花为对象,通过观察其开花动态、昆虫访花行为,测定花粉活力、柱头可授性、杂交亲和指数等,研究其传粉特性及杂交亲和性。【结果】海菜花和波叶海菜花开花动态基本相似,单花期均为7~11 h,访花昆虫主要有黑带食蚜蝇、中华蜜蜂等;花粉活力和柱头可授性均呈现先上升后下降趋势,海菜花和波叶海菜花花粉活力最高分别为88.27%和88.34%,柱头可授性均在开花期Ⅱ最高;两者正反交的坐果率分别为85.71%和91.33%,杂交亲和指数均大于53,单果平均种子数自交分别为54和69,正反交分别为73和71;种子萌发率自交分别为71.7%和27.3%,正反交分别为22.6%和19.7%。【结论】海菜花和波叶海菜花的开花动态基本相似,单花期时间较短,传粉昆虫种类偏少,有性繁殖受到影响,未表现出显著的杂交不亲和性。
Abstract
[Objective] The study aims to reveal the pollination Ottelia acuminata and O. acuminata var. crispa, elucidate the factors affecting successful pollination, and provide theoretical and technical guidance for hybrid breeding between the two species. [Methods] Using O. acuminata and O. acuminata var. crispa as subjects, by observing their flowering dynamics, insect visitation behaviors, and measuring pollen viability, stigma receptivity, and hybrid compatibility index, the study investigated their pollination characteristics and hybrid compatibility. [Results] The flowering dynamics of O. acuminata and O. acuminata var. crispa were fundamentally similar, with each flower lasting 7-11 h. The main pollinating insects include Episyrphus balteatus and Apis cerana. The vitality of the pollen and the receptivity of the stigma both showed an initial increase followed by a decrease. The peak pollen viabilities for O. acuminata and O. acuminata var. crispa were 88.27% and 88.34%, respectively, and the stigmas were all the highest at anthesis Ⅱ. The fruit set rates for direct and reciprocal crosses were 85.71% and 91.33%, respectively, with hybrid compatibility indices both greater than 53. The average number of seeds per fruit for self-pollination were 54 and 69, respectively, and for direct and reciprocal crosses, 73 and 71, respectively. The seed germination rates for self-pollination were 71.7% and 27.3%, respectively, and for direct and reciprocal crosses, 22.6% and 19.7%, respectively. [Conclusion] The flowering dynamics of O. acuminata and O. acuminata var. crispa are fundamentally similar, with each having a short flowering period. There are fewer types of pollinating insects, which affects sexual reproduction, yet there is no significant evidence of hybrid incompatibility.
海菜花[Ottelia acuminata(Gagnep)Dandy]和波叶海菜花(Ottelia acuminata var.crispa)属水鳖科(Hydrocharitaceae)海菜花属(Ottelia Pers.)。海菜花主要生长于中国西南地区喀斯特地貌的湖泊、沟渠、池塘等特殊环境中,而波叶海菜花为海菜花的一个变种,仅分布于云南省和四川省交界的泸沽湖境内[1]。两者分布范围狭窄,且具有明显的区域特性,为中国特有种,于2021年均列入《国家重点保护野生植物名录》(Ⅱ级)(国家林业和草原局政府网)。同时海菜花与波叶海菜花还具有食用、观赏、药用、作为饲料、水环境监测和指示等重要资源价值[2]。根据课题组30余年的野外跟踪调查,在其分布区,随着其生长水环境水域面积不断缩小,水体污染日期严重,乱采乱挖等人为破坏严重,植株和种群数量急剧减少,不少野生种群已经消亡或濒临绝迹。两者为雌雄异株大型沉水植物,主要通过种子繁殖,在云南大理、丽江等地的野外种群中,当地居民大量采摘雌株的花序食用或出售,种群中鲜见实生苗,种群更新受到严重影响。海菜花属水生异交植物,其传粉受开花物候、花粉质量、花粉数量、花粉运动、柱头可授性和水体生态环境等的影响,物种或种群之间长期受到地理隔离,从而对植物个体间的基因流和群体交配构成限制。
国内外学者对珍稀濒危植物的传粉生物学或杂交等方面进行了大量的研究工作,为濒危植物的保护积累了丰富的资料,如:细果秤锤树(Sinojackia microcarpa)[3]、多花兰(Cymbidium floribundum)[4]、丰都车前(Plantago fengdouensis)[5]等。目前国内外对海菜花研究主要为形态学、细胞学和分子生物学等方面,繁育生物学的相关研究仍显不足[6-11],有关研究主要集中于外界因素对种子萌发的影响[12-17]、花粉限制或败育等[18]。王銮凤等[19]对该属植物的水菜花(Ottelia cordata)开展传粉生物学研究,主要探讨传粉昆虫及其访花行为。但未见海菜花和波叶海菜花的传粉生物学及其杂交亲和性的系统研究报道。该研究以海菜花和波叶海菜花为试验材料,通过观察其开花动态、昆虫访花行为,测定花粉活力、柱头可授性,套袋杂交试验等,研究其传粉特性及杂交亲和性,以探讨其种群的繁育特征和传粉适应策略,为判断最佳授粉时间和杂交组合提供依据。通过杂交试验进行海菜花新品种的选育,创造新的种质资源,为海菜花属其他种的繁育、杂交育种和种质资源保存研究提供借鉴和理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
海菜花采自云南省鹤庆县(100°10′43″E,26°35′44″N,海拔2 188.7 m),波叶海菜花采自云南省宁蒗县(100°46′5″E,27°41′50″N,海拔2 693.1 m),种植1年后于2023年6月盛花期开始试验。
1.2 开花动态及传粉昆虫观察
选定样株,挂牌标记,每日观察开花动态过程和传粉昆虫并拍照记录。按照开花动态过程分成5个时期(花蕾期、开花期Ⅰ、开花期Ⅱ、开花期Ⅲ、凋谢期),每日观察花序发育情况,直至花瓣脱落,确定单花的开花时间。
1.3 不同时期花粉活力和柱头可授性测定
测定雄花5个开花时期的花粉活力。将花粉用毛刷轻轻从花药上扫下,带入实验室中,用MTT(噻唑蓝)染色液对其进行染色,静置8~10 min,进行镜检。有活力的花粉被染色,反之没有活力[20]。染色率=(被染色花粉粒数/视野中花粉粒总数)×100%;每个视野上花粉粒数>100;视野数>3,染色率的平均值可以作为花粉活力的指标[21]。同时,对雌花的5个开花时期进行柱头可授性测定,采用MTT(噻唑蓝)染色法:将柱头浸没在MTT溶液中,2~15 min内观察柱头的颜色变化。若柱头出现紫黑色,表示柱头可授性高;若柱头呈现浅蓝色或者变色不明显,表明柱头可授性差,不具有可授性[22]。
1.4 杂交授粉试验
在雌花开放前对海菜花和波叶海菜花进行套袋,以免其他花粉进入。待母本柱头分泌大量黏液时,将父本花粉涂抹于母本柱头上,当天重复2次。杂交组合为:T1,海菜花(♂)×海菜花(♀);T2,波叶海菜花(♂)×波叶海菜花(♀);T3,海菜花(♂)×波叶海菜花(♀);T4,波叶海菜花(♂)×海菜花(♀),每个杂交组合授粉20~24朵,授粉60 d后采集各杂交组合的果实,统计坐果数、种子数等各项指标。
1.5 播种与萌发率统计
将杂交种子用浓度为0.3%高锰酸钾溶液消毒30 min,再用蒸馏水反复清洗,随后播种,统计各杂交组合种子的萌发率[23]。
1.6 数据处理与分析
用Excel 2022软件录入观测记录的数据,用SPSS 27进行显著性分析,用Origin 2021软件作图。
2 结果与分析
2.1 开花动态及传粉昆虫
海菜花与波叶海菜花开花动态基本一致,单花期均为7~11 h。花蕾期:多数花蕾处于近水面,也有少数的花蕾一半伸出水面,极少数的花蕾全部伸出水面,等待开放,此阶段持续时间2~3 h;开花期Ⅰ:花朵伸出水面,雌花和雄花的花萼展开,花瓣未完全展开,雄花的花丝和雌花的柱头颜色由浅黄色变为黄色,雄花花瓣上可见花粉,此阶段持续时间1~2 h,花粉散粉量达到高峰;开花期Ⅱ:雌花和雄花的花瓣不断展开,花药的散粉量不断减少,柱头颜色由黄色变为深黄色,此阶段持续时间1~2 h(图1、图2);开花期Ⅲ:雌花和雄花完全展开,花药散粉趋向结束,此阶段持续时间3~4 h;凋谢期:雌花和雄花的花瓣透明状,逐步凋谢。
图1海菜花的开花动态
Fig.1Flowering dynamics of O. acuminata
A.花蕾期;B.开花期Ⅰ;C.开花期Ⅱ;D.开花期Ⅲ;E.凋谢期;1.雄花;2.雌花。标尺=1 cm。图2同。
A. Budding phase. B. Blooming phase Ⅰ. C. Blooming phase Ⅱ. D. Blooming phase Ⅲ. E. Withering phase.1, male flowers.2, female flowers. Bar=1 cm. The same as Fig.2.
图2波叶海菜花的开花动态
Fig.2Flowering dynamics of O. acuminata var. crispa
图3海菜花与波叶海菜花的传粉昆虫
Fig.3Pollinators of O. acuminata and O. acuminata var. crispa
A.黑带食蚜蝇;B.中华蜜蜂;C.瓢虫科昆虫;D.蟌科昆虫;E、F.蝇科昆虫。
A. Episyrphus balteatus. B. Apis cerana. C. Coccinellaidae. D. Coenagrionidae sp.. E, F. Muscidae sp..
表1海菜花和波叶海菜花访花者访问雄花与雌花的频率
Table1The frequency of visitor visits to male and female flowers of O. acuminatar and O. acuminata var. crispa
海菜花和波叶海菜花访花昆虫主要有黑带食蚜蝇(Episyrphus balteatus)、中华蜜蜂(Apis cerana)、熊蜂(Bombus sp.)和瓢虫科(Coccinellidae)等昆虫,这些昆虫访花高峰期均在上午10:00—12:00。根据多日连续观察发现,这些昆虫访问雌花的频率均小于雄花,访问雄花频率最高为78,雌花为23,雄花访问频率为雌花的3.39倍(图3、表1)。
2.2 海菜花与波叶海菜花不同发育阶段花粉活力及柱头可授性
由表2所示,波叶海菜花与海菜花的花粉活力和柱头可授性变化趋势差异较小,均呈现出先上升后下降的趋势。
表2海菜花和波叶海菜花的花粉活力及柱头可授性
Table2Pollen viability and stigma pollinability in O. acuminata and O. acuminata var. crispa
注:+表明可授性强度,+越多证明可授性越强,反之越弱;不同小写字母代表不同时期间在0.05水平下的差异显著(P<0.05)。
Note: + indicates the degree of receptivity, the more + the stronger. Different lowercase letters represent significant differences between different periods (P< 0.05) .
图4花粉活力染色
Fig.4Pollen vigor staining
a.花粉活力较高的花粉粒;b.花粉活力中等的花粉粒;c.花粉活力较低或无花粉活力的花粉粒。
a, pollen grains with high pollen viability. b, pollen grains with medium pollen viability. c, pollen grains with low or no pollen viability.
图5海菜花及波叶海菜花花粉活力差异
Fig.5Differences in pollen viability between O. acuminata and O. acuminata var. crispa
不同小写字母代表不同时期差异显著(P<0.05)。
Different lowercase letters represent significant differences between different periods (P<0.05) .
由图4和图5可知,花蕾期海菜花花粉活力为79.28%,波叶海菜花花粉活力为73.11%,此时海菜花和波叶海菜花的柱头可授性较高。海菜花在开花期Ⅲ时花粉活力最高,为88.27%,而波叶海菜花在开花期Ⅱ时最高,为88.34%。2种植物的柱头可授性最高水平均在开花期Ⅱ。在花冠完全展开后,两者花粉活力和柱头可授性均开始下降,至凋谢期,花粉活力和柱头可授性均降至低水平,此时海菜花花粉活力为19.22%、波叶海菜花花粉活力为28.01%。
2.3 杂交亲和性
如表3所示,海菜花和波叶海菜花正反交的坐果率都很高,均在85%以上;亲和指数也均在53以上,证明海菜花与波叶海菜花不存在杂交不亲和的情况,杂交单果平均种子数最高为T3组合,为73,其次T4组合,为71,T2组合,为69,T1组合,为54。
2.4 F1代种子的外形特征及萌发率
如图6所示,母本为波叶海菜花的种子和母本为海菜花的种子在外观上区别较大,母本为海菜花的种子上表面黏液较多,外观为细长形;母本为波叶海菜花的种子表面黏液较少,外观为椭圆形。如表4所示,在各杂交组合中,T3组合种子千粒重最高,为3.334 g,其次为T2组合种子千粒重为3.292 g,T4组合种子千粒重为2.964 g,T1组合种子千粒重为2.766 g。60 d后将各组合种子进行萌发试验,结果显示T1组合发芽率最高,为71.7%。其他3个组合,发芽率较低(T2为27.3%,T3为22.6%,T4为19.7%)。
表3海菜花与波叶海菜花杂交亲和性
Table3Affinity of hybridization between O. acuminata and O. acuminata var. crispa
图6F1代种子外形
Fig.6Shape of the F1 generation seeds
A.母本为海菜花的种子;B.母本为波叶海菜花的种子。
A. Seeds from maternal O. acuminata. B. Seeds from maternal O.acuminata var. crispa.
表4F1代种子千粒重与发芽率
Table4Thousand kernel weight and germination rate of F1 generation seeds
3 讨论
被子植物能否顺利完成有性生殖通常受到花粉萌发、传粉、雌雄配子发育与外界因子变化[24]等因素的影响。作为影响植物繁育重点内容之一的传粉生物学研究,有助于揭示珍稀濒危植物的濒危机制[25]。本研究中海菜花及波叶海菜花均为雌雄异株,异花授粉,能有效避免近交衰退,以提高后代适应水体环境的能力。通过观察发现,两者主要的传粉昆虫为黑带食蚜蝇和中华蜜蜂等,这与王銮凤等[19]对同属植物水菜花的研究和 Yang等[26]的研究结果一致。海菜花和波叶海菜花传粉昆虫种类少,影响传粉,不同个体之间交配产生的后代数量受到影响,而且云南大理、丽江等地当地居民大量采摘雌株的花序食用或出售,导致种群雌雄比严重失调,植株有性繁殖有较大障碍,实生苗鲜见,可能就成为海菜花濒危的原因之一。为使濒危物种得到更好的保护和种群恢复,需要进行保护区域的划定,做好当地居民及外来者的保护宣传工作。
经过30多年的野外观察发现,海菜花及波叶海菜花与陆生植物不同,由于生境的多样性和其生存繁殖适应性需要,使该植物产生强烈的叶形变化和花部分化,其总花柄在水深1 m以上其基部通常出现螺旋结构,为确保单花开花时花柄伸出水面完成传粉受精或受精结实后回缩于水下不易被折断以保障其繁殖成功率,花部的形状、气味和颜色都是植物能吸引昆虫进行传粉的重要因素[27-29]。通过对两者开花物候观察,其头状花序在适宜的温度下全年开花,在开花过程中,花柄伸出水面,花冠艳丽,种群或群落在水面能形成白色花海的景观,提高了虫媒传粉效率。波叶海菜花在具有海菜花传粉优势的同时,其花蕊具有特殊味道,可能成为吸引昆虫的因素,为增强波叶海菜花的成功传粉提供条件,两者须在水面上完成传粉受精,受精后的子房在水下完成生长发育形成果实,这可能是长期适应水体环境的结果。
花粉活力和柱头可授性是保证传粉成功的前提[30],当花粉活力与柱头可授性均为高水平时,即为最佳的传粉时间,有助于植物成功传粉受精[31]。海菜花及波叶海菜花的花粉在花蕾期有较强活力,之后不断提升,直至最高,海菜花花粉活力最高在开花期Ⅲ,为88.27%,波叶海菜花花粉活力最高在开花期Ⅱ,为88.34%,与之对应的柱头可授性,均在开花期 Ⅱ 最高,为两者成功传粉受精提供了有效保障。
通过杂交选育优良种质资源,是保护濒危植物的重要手段。在选育海菜花优质种植资源时,遵循亲缘关系越近的亲本杂交亲和性越好的原则[32-33]。本次研究中用海菜花与波叶海菜花杂交,其正反交坐果率都达到85%以上,亲和指数都达到53以上,表明海菜花与波叶海菜花不存在杂交不亲和的现象。但通过F1代种子发芽试验,各杂交组合发芽率不相同,推测可能是两者虽不存在杂交不亲和的情况,但杂交种子来自于不同亲本,而前期研究发现海菜花的父本有染色体变异或出现微核的情况[9],会产生更多的遗传变异,这些变异可能导致种子在萌发过程中出现不同程度的障碍[34];也可能是杂交种子的胚胎发育受到基因互作和表达的复杂影响,不同基因的互相作用可能会导致胚胎发育的不正常,从而影响种子的发芽率[35];况且杂交种子与非杂交种子可能在种子萌发和生长过程中存在生理上的差异,影响种子的发芽率[36]。
海菜花与波叶海菜花是中国西南特产或在特定的地区栽培的一种水生蔬菜和景观植物,对水质和环境要求较高,对其杂交缺乏研究,对传粉生物学研究不足,通过传粉生物学和杂交的研究,为进一步解释海菜花的濒危机制提供理论依据,对海菜花属植物的资源保护、种质资源创新具有重要意义。
4 结论
(1)海菜花和波叶海菜花的开花动态相似,单花期较短,仅有7~11 h,且两者主要传粉昆虫种类偏少,有性繁殖受到影响;
(2)海菜花和波叶海菜花均为雌雄异株,异花传粉植物,两者在开花期 Ⅱ 时,花粉活力较高,柱头可授性最高,不存在花期不遇的问题,进而提高了传粉效率;
(3)海菜花和波叶海菜花正反交坐果率分别为85.71%、91.33%,且杂交亲和指数均在53以上,表明其不存在杂交不亲和的情况,可为进行杂交选育工作提供指导。