摘要
【目的】 探究侧柏珠孔闭合过程，以丰富裸子植物珠孔闭合数据，为研究裸子植物系统发育提供参考。【方法】以侧柏雌球花为材料，通过石蜡切片及扫描电子显微镜等形态学方法观察授粉后胚珠发育过程；同时基于珠孔闭合方式对本内苏铁和其他现存裸子植物进行聚类分析。【结果】(1)侧柏花粉进入胚珠后，珠孔端珠被最内侧2层细胞开始辐射状向内横向生长，直至将珠孔完全堵塞。(2)侧柏珠孔闭合过程中，珠被细胞为长圆锥形，细胞层数增多至4~6层。(3)裸子植物珠孔闭合方式可分为4类：其中苏铁、银杏为一类，松属植物与罗汉松科植物为一类，本内苏铁单独一支，侧柏及其他种聚为一类。【结论】侧柏珠孔闭合过程不同于苏铁类植物和银杏，但与松科植物及本内苏铁的珠孔闭合过程类似，这暗示本内苏铁与现存松柏类植物在珠孔闭合有一定的演化关系，为理解裸子植物生殖系统演化提供新的形态学依据。
Abstract
[Objective] In order to enrich the data for the study of micropyle closure in gymnosperms and to provide a reference for the phylogenetic study of gymnosperms, micropyle closure of Platycladus orientalis Franco was investigated. [Methods] Female cones of P. orientalis were sampled and examined using morphological techniques, including paraffin section and scanning electron microscopy. In addition, cluster analysis of the mode of micropyle closure was conducted for Bennettitales. [Results] (1) After pollen enters the ovule, the innermost two cell layers of the integument began to grow radially inward until the micropyle was completely closed. (2) During the micropyle closure, the innermost cells of the integument were elongated and became conical in shape, with the cell layers typically increased to 4 to 6 layers. (3) The micropyle closure of gymnosperms could be divided into four clades: One for Cycas and Ginkgo, one for Pinus and Podocarpaceae, a separate group for Bennettitales, and a cluster of P. orientalis and other species. [Conclusion] The micropyle closure of P. orientalis differs from Ginkgo and cycads, which is similar to Pinus and Bennettitales. This study suggests that there is an evolutionary relationship in micropyle closure between Bennettitales and existing conifers, providing novel morphological evidence for the understanding of evolution of the reproductive systems of gymnosperms.
Keywords
珠孔位于种子植物胚珠顶端，为珠被包被珠心组织后形成的孔道[1]。作为雄配子体进入雌配子体的通道，珠孔在植物受精过程中具有关键作用[2]。与被子植物相比，裸子植物不具有心皮包被[3]。在授粉期间，大多数裸子植物于珠孔处形成授粉滴捕获花粉[4]。通过授粉滴回缩机制，花粉被带入珠心组织处的贮粉室后萌发形成花粉管[5]。在该过程中，珠孔始终保持张开状态，部分裸子植物类群的珠心组织可透过珠孔直接观察到[6]。因此，为避免其他植物的花粉、真菌孢子等通过珠孔进入珠心组织内部而造成胚珠败育，裸子植物在授粉完成后会通过不同的珠孔闭合方式来封闭珠孔[7]。
目前，对裸子植物珠孔闭合方式的研究尚显不足。在古生代种子蕨植物Callospermarion 中发现最早的授粉滴，但其珠孔闭合方式还不为人知[8]; 苏铁科（Cycadaceae）植物珠孔闭合的方式为雌配子体膨大，推动中心柱向上生长，形成类似塞子的结构封堵珠孔[9-10]。本内苏铁目（Bennettitales）植物的珠孔闭合方式为珠孔端珠被内层细胞放射状径向增长堵塞部分珠孔，同时中心柱向上膨大，完全封闭珠孔[11]。
银杏（Ginkgo biloba）的珠孔闭合方式存在一定争议:一种说法是银杏科植物的珠孔闭合方式类似于苏铁科[9，12]; 另一种说法则认为靠近珠孔上方的细胞不再生长，而珠孔端下方的珠被细胞继续向内生长以逐渐闭合珠孔[13-14]。松科（Pinaceae）植物珠孔闭合方式与上述各珠孔闭合方式不同，主要通过珠被细胞从内向外第2层多个细胞膨大并横向增长堵住珠孔[15]，随后种鳞和苞鳞通过细胞增殖和膨大来共同阻止外物进入。杉木（Cunninghamia lanceolata）珠孔闭合方式类似于银杏的第2种闭合方式，即珠孔端下方的珠被细胞通过细胞分裂增加近珠孔端的珠被细胞数量，继续向顶生长以封闭珠孔[16]。关于柏科侧柏属植物的珠孔闭合方式，目前尚鲜见研究报道。
大多数裸子植物珠孔闭合与珠被发育有关，但裸子植物珠被发育的分子机理研究较少。在被子植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中发现，外珠被中所表达的 KNAT1基因可使外珠被外层细胞产生额外的细胞分裂[17]。此外，油菜素甾醇（Brassinosteroids）可能通过 BZR1调节INO 的转录活性，从而部分调控外珠被生长发育过程[18]。在水稻（Oryza sativa）中，DNA甲基化也参与了珠被发育调控[19]。Gomez等研究表明，DELLAs和 ATS 蛋白相互作用，形成1个转录复合物，共同调控外珠被生长基因表达[20]。然而，裸子植物中珠被发育的分子机制是否类似于被子植物仍存在疑问，尚待进一步探究。
珠孔闭合方式是裸子植物生殖生物学中的关键，对研究裸子植物系统发育关系具有重要的参考意义。由于化石保存的局限性，很难观察已灭绝的裸子植物珠孔闭合方式[21]。本内苏铁作为曾经假想的被子植物祖先，其生殖生物学的研究资料较为详实[22]，是理解珠孔闭合方式演化的重要材料。目前，本内苏铁与被子植物祖先的关系得到进一步证实[23-24]。理解本内苏铁的生殖特征演化过程对被子植物起源研究具有重要的参考价值[25]。
本研究选择柏科植物的代表物种侧柏（Platycladus orientalis Franco）[26]为对象，利用石蜡切片、扫描电子显微镜等形态学手段探究其珠孔闭合过程，并通过聚类分析方法对已知的裸子植物珠孔闭合的方式进行研究，以此探讨裸子植物珠孔闭合方式的演化过程，为理解裸子植物系统发育关系提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 研究地概况
研究地位于陕西省咸阳市杨凌区西北农林科技大学南校区一号教学楼东侧（108°3'E，34°16'N，海拔451m）。试验材料为侧柏树上的雌球花，树龄约 30年，发育状况良好。
1.2 研究方法
1.2.1 采样时间
样品采集时间为2016年9月-2017年4月，于植株各方向进行随机取样，采样时观察并记录珠孔闭合情况。其中2016年9月-2017年2月每周采集侧柏雌球花10个，2017年2-4月隔天采集侧柏雌球花10个。样品采集后用 FAA 固定液（冰醋酸∶甲醛∶70%乙醇=5∶5 ∶90）进行固定处理。
1.2.2 石蜡切片
用经典石蜡切片法将样品制成永久切片[27]。样品包埋后使用半自动切片机（Leica RM 2245）进行石蜡切片，切片厚度为8~12μm。切片采用番红-固绿染色，使用中性树脂永久封片，利用生物显微镜（Leica DM 4000B）拍照观察。
1.2.3 扫描电子显微镜
将 FAA 固定的样品经梯度酒精溶液（70%、 80%、90%、100%、100%）进行脱水处理。用100% 乙酸异戊酯溶液替换100%酒精溶液，随后使用二氧化碳临界点干燥仪（Quorum K850）对样品进行干燥处理。将样品用导电胶固定在样品台上，在42~43 mA 强度的电流下喷金200s，用扫描电子显微镜（ZEISS DSM 950）进行扫描电镜观察。使用 Photoshop 2021和 Adobe Illustrator 2021 进行图片排版及模式图制作。
1.2.4 层次聚类分析
通过搜集已报道的现存裸子植物和本内苏铁化石植物的珠孔闭合结果，建立珠孔闭合形态特征集，进行层次聚类分析，使用欧几里德法计算不同物种珠孔闭合方式数据间的距离，连接方法为 Ward 法[28]。使用软件R 4.3.1进行数据处理和统计分析。
2 结果与分析
2.1 侧柏珠孔闭合时间
侧柏授粉期可从3月上旬持续至下旬。在珠孔闭合过程中，个体差异明显。侧柏珠孔于3月15日左右开始闭合，在3月30日左右完全闭合。侧柏珠孔闭合过程较为迅速，珠孔闭合最短可在4d内完成，且几乎所有个体都能在15d内完成珠孔闭合。
2.2 侧柏珠孔闭合过程
对侧柏珠孔闭合期间样品的纵切石蜡切片进行观察，结果表明，3月11日，由于刚完成授粉过程，珠孔处于最大开放状态，此时珠孔端珠被细胞未发生明显变化。纵切面视图中珠被细胞层数为3~4 层（图1，A-B）; 3月15日，花粉通过授粉滴回缩到达贮粉室，此时，位于珠孔端的珠被最内侧细胞开始发生轻微的横向增长并紧密排列，体积增大，细胞核也随之移至细胞中央（图1，C）; 3月17日，位于珠心组织上方的部分珠被内侧细胞明显横向增长，次内侧细胞发生轻微横向增长。此外，内侧部分细胞发生1次有丝分裂（图1，D）; 3月19日，最内侧细胞继续有丝分裂并横向增长，几乎完全堵住珠孔。此时珠被细胞层数为4~6层，各细胞体积减小，排列紧密（图1，E）。3月29日之后，珠孔完全闭合。珠孔闭合纵切面模式图如图2所示。
图1侧柏大孢子叶球珠孔部位纵切
Fig.1Longitudinal paraffin sections of a female cone of P. orientalis
A.3月11日大孢子叶球纵切; B.图 A 的细节放大; C.3月15日大孢子叶球纵切; D.3月17日侧柏大孢子叶球纵切; E.3月19日侧柏大孢子叶球纵切。i.珠被; m.珠孔; n.珠心组织。
A. On March 11, longitudinal section of a female cone. B. Detailed view of A. C. On March 15, longitudinal section of a female cone. D. On March 17, longitudinal section of a female cone. E. On March 19, longitudinal section of a female cone. i, integument. m, micropyle. n, nucellus.
图2侧柏珠孔闭合过程纵切模式图
Fig.2Model diagram of longitudinal sections of a female cone of P. orientalis during micropyle closure
A-E.珠孔段珠被内层细胞开始增长生长至完全堵住珠孔过程。i.珠被; m.珠孔; n.珠心组织。红色表示参与珠孔闭合的细胞。
A-E. The inner cells of integument near the micropyle begin to grow until closing the micropyle. i, integument. m, micropyle. n, nucellus. Red color showing cells involved in micropyle closure.
对侧柏珠孔闭合期间样品的横切石蜡切片进行观察，结果表明，3月11日，由于刚完成授粉过程，此时珠孔处于最大开放状态，呈圆筒状，细胞层数约为3层（图3，A）; 3月15日，最内侧细胞向中央生长，细胞核随之移向细胞中央，细胞层数为3~4层（图3，B）; 3月17日，最内侧细胞迅速向中心生长，次内侧细胞向中心轻微增长，珠被细胞层数约为4层（图3，C）; 3月19日，最内侧细胞继续向中央靠拢，细胞形状由长方体变为类似圆锥体，几乎完全堵住珠孔，细胞核移至细胞中央，细胞层数为4~6层（图3，D）。珠孔闭合横切面模式图如图4所示。
2.3 侧柏珠孔闭合过程中花粉及雌配子体发育
授粉完成后，珠孔闭合伴随花粉萌发及雌配子体发育。3月15日，当珠孔开始闭合时，雌配子体内处于大孢子阶段（图5，A），随后大孢子经过有丝分裂进入游离核阶段。3月17日，雌配子体发育为早期游离核阶段（图5，B）。3月23日，珠心组织顶端部分花粉开始萌发形成花粉管（图5，C-F）。在授粉时，珠心组织顶端部分细胞的作用是分泌授粉滴。该部分细胞在分泌授粉滴后细胞核完全裂解，仅剩完整的膜结构（图5，C-D）。在珠孔闭合过程中，珠心组织处于早期游离核阶段。
图3侧柏大孢子叶球珠孔部位横切
Fig.3Transverse paraffin sections of micropyle of the female cones in P. orientalis
A.3月11日侧柏大孢子叶球横切; B.3月15日侧柏大孢子叶球横切; C.3月17日侧柏大孢子叶球横切; D.3月19日侧柏大孢子叶球横切。i.珠被; m.珠孔。
A. On March 11, transverse section of female cones. B. On March 15, transverse section of female cones. C. On March 17, transverse section of female cones. D. On March 19, transverse section of female cones. i, integument. m, micropyle.
图4侧柏珠孔闭合过程横切模式图
Fig.4Model diagram of transverse sections of a female cone of P. orientalis
A-D.珠孔段珠被内层细胞开始增长生长至完全堵住珠孔过程。i.珠被; m.珠孔。红色表示参与珠孔闭合的细胞。
A-D. The inner cells of integument near the micropyle begin to grow until occluding the micropyle. i, integument. m, micropyle. Red color showing cells involved in the enclose of micropyle.
图5侧柏珠孔闭合中的花粉及雌配子体发育
Fig.5Pollen germination and development of female gametophyte during micropyle closure in P. orientalis
A.3月15日大孢子阶段（横切）; B.3月17日游离核阶段（纵切）; C-D.3月23日游离核继续发育（纵切）; E-F.珠心组织顶部扫描。i.珠被; m.珠孔; n.珠心组织; p.花粉; pt.花粉管; fn.游离核; ms.大孢子。
A. On March 15, megaspore stage (cross) . B. On March 17, the early free nucleus stage (longitudinal) . C-D. On March 23, the free nucleus stage (longitudinal) . E-F. On March 23, SEM of nucellus. i, integument. m, micropyle. n, nucellus. p, pollen. pt, pollen tube. fn, free nucleus. ms, megaspore.
2.4 珠孔闭合的进化生物学研究
选择裸子植物珠孔闭合过程中的关键性状（中心柱、珠孔细胞增殖与增殖细胞的位置）绘制成数据矩阵（表1）以进行层次聚类分析。聚类分析结果表明，已报道的裸子植物珠孔闭合方式可分为4个分支。苏铁和银杏的珠孔闭合方式聚在一起，其闭合过程为中心柱向上封堵珠孔（图6，A）。松属植物欧洲黑松（Pinus nigra）与罗汉松科南洋叶枝杉（Phyllocladus hypophyllus）聚为 1 个族群，它们的珠孔闭合方式为珠被内侧第2，3层细胞膨大闭合珠孔（图6，B）。
本内苏铁目威氏苏铁属（Williamsonia）植物的珠孔闭合方式单独为一支，其珠孔闭合由中心柱与珠孔细胞增殖2部分共同完成（图6，C）。三尖杉（Cephalotaxus fortunei）、叶麻黄（Ephedra foliata）以及柏科植物疏叶杉（Athrotaxis laxifolia）、侧柏（Platycladus orientalis）与日本柳杉（Cryptomeria japonica）聚为1个族群（图6，D），这些种的珠孔闭合方式比较相似，都是通过珠被最内侧细胞增殖膨大完成闭合。
表1裸子植物珠孔闭合形态特征
Table1Morphological characteristics of micropyle closure of gymnosperms
注：表中各性状为“定性性状”，“0”表示该性状缺失，“1”表示该性状存在。
Note: The traits in the table are “qualitative traits”, where “0” indicates the absence of the trait and “1” indicates the presence of the trait.
图6基于珠孔闭合方式的部分裸子植物聚类树状图
Fig.6Clustering dendrogram of selected gymnosperms based on the micropyle closure
A.苏铁珠孔闭合方式；B.欧洲黑松珠孔闭合方式； C.威氏苏铁属珠孔闭合方式；D.侧柏珠孔闭合方。 i.珠被；m.珠孔；n.珠心组织；cc.中心柱；nb. 珠心喙。红色表示参与珠孔闭合的细胞。
A. Enclosing process of micropyle in Cycas revoluta. B. Enclosing process of micropyle in Pinus nigra. C. Enclosing process of micropyle in Williamsonia. D. Enclosing process of micropyle in Platycladus orientalis. i, integument. m, micropyle. n, nucellus. cc, central column. nb. nucellus beak. Red color showing cells involved in the enclose of micropyle.
3 讨论
3月上旬，授粉滴捕获花粉后，在一定的时间内完成回缩，将花粉带入贮粉室[31]。同时，授粉滴内含有的氨基酸、钙离子等物质为花粉萌发和花粉管生长提供条件[8，32]。花粉萌发与珠孔闭合几乎同时进行（图5，E），但花粉萌发是否启动珠孔闭合还有待进一步试验确认。启动侧柏珠孔闭合的机制可能有以下2种：（1）花粉进入贮粉室，花粉管开始萌发，这一过程启动珠孔闭合；（2）无论是否有花粉进入，珠孔在一定时间内都会闭合。该机制可能是由于授粉滴回缩，珠孔内部分细胞感受到光周期的变化才发生生长和增殖。对于这2种推测，本研究中尚未进行相关试验证实，可通过套袋不授粉实验验证花粉或花粉萌发在启动珠孔闭合时是否发挥作用。然而可以肯定的是，无论以上那种方式，珠心组织在珠孔闭合阶段一直处于游离核时期，没有参与珠孔闭合过程（图5）。在被子植物中，珠被发育与INO以及BZR1密切相关，但侧柏珠被细胞分裂的调控机制是否与这2种转录因子有关，还有待进一步验证[33]。
珠孔闭合是裸子植物保护珠心组织的重要方式之一。侧柏的珠孔闭合方式不同于已报道的裸子植物珠孔闭合方式。聚类分析结果表明，已经报道的裸子植物珠孔闭合方式可分为以下4类：（1）花粉进入贮粉室后，珠心组织和雌配子体的生长推动中心柱向上封堵珠孔[9-10]（图6，A）。在这种方式中，没有特定的珠孔闭合细胞行为，中心柱的堵塞过程较珠孔端细胞伸长过程更耗时，所以这种方式较为原始。（2）松科植物珠孔闭合是通过珠被内侧第2、3层细胞进行膨大伸长来完成[15]（图6，B）。（3）中心柱封堵珠孔的同时，珠被细胞增殖膨大闭合珠孔（图6，C）。该机制出现在已灭绝的裸子植物本内苏铁中[11]。（4）侧柏的珠孔闭合是通过珠孔端珠被最内侧2层细胞膨大伸长来完成（图2）。其中，第3、4种珠孔闭合方式本质上都是部分珠被细胞增殖生长封堵珠孔（图6，B、D）。该方式存在于现存大多数松柏类植物中，且各类群增殖细胞的位置具有较大差异。杉木的珠孔闭合是通过珠孔端下部的细胞向顶生长来完成[16]。在珠孔闭合完成之后，松柏类植物珠被外侧的种鳞和苞鳞会有激增合拢的行为，以更好保护胚珠[34-35]。
本内苏铁可能与被子植物祖先有密切关系[23-24]。就珠孔闭合方式而言，本内苏铁的珠孔闭合方式既与苏铁银杏类植物的中心柱有关，又与松柏类珠被细胞增殖的珠孔闭合方式相关。这暗示本内苏铁的珠孔闭合方式是苏铁银杏类向松柏类的过渡类型。这对理解本内苏铁的系统位置具有重要意义，也为被子植物祖先生殖特征重建提供参考。在本研究中，作者仅使用参与珠孔闭合的形态特征构建矩阵，未涉及其他形态特征。因此，在后续关于裸子植物生殖演化的研究中，还需补充其他相关数据，例如授粉方式、胚珠着生位置、珠心组织结构以及花粉形态等。
作者深入研究裸子植物珠孔闭合这一生殖过程，揭示了侧柏在珠孔闭合方面与其他裸子植物的独特差异。该研究只针对侧柏珠孔闭合过程进行探讨，尚未对柏科其他属植物珠孔闭合过程进行观察，因此不能断定除柳杉属与密枝杉属外柏科其他植物是否与侧柏的珠孔闭合过程相同。但是，该研究的方法对研究其他裸子植物珠孔闭合过程具有推广意义。此外，为更全面地理解裸子植物生殖特征的演化，有必要使用分子生物学手段对其他裸子植物的珠孔闭合方式进行研究。侧柏是中国古树名木代表树种，具有重要的观赏、药用、经济和生态价值。通过研究侧柏生殖发育过程，对其种质资源的保护和利用具有重要意义。
4 结论
（1）侧柏珠孔闭合过程与松科植物类似，都通过珠被细胞增殖完成。侧柏通过珠被最内侧2层细胞辐射状向内横向生长封闭珠孔，而松科植物通过珠被内侧第2、3层细胞膨大伸长完成珠孔闭合。
（2）裸子植物珠孔闭合主要与珠被和中心柱有关。其中，苏铁、银杏类以中心柱封堵珠孔；本内苏铁类珠孔闭合由中心柱与珠孔细胞增殖两部分共同完成；松柏类植物以珠被细胞增殖生长封堵珠孔。
（3）本内苏铁的珠孔闭合过程介于苏铁、银杏类和松柏类之间，暗示本内苏铁与松柏类具有密切关系。珠孔闭合是重要的生殖过程，在一定程度可以反映裸子植物系统发育关系，为裸子植物生殖进化研究提供参考。
