摘要
【目的】 分析低温胁迫下褪黑素(MT)对葡萄悬浮细胞生长、生化特性及冷响应相关基因表达的影响，筛选适宜MT浓度，探究MT增强葡萄耐冷性的作用机制。【方法】以‘黑比诺’葡萄悬浮细胞为试材，在低温(4 ℃)胁迫下，考察不同浓度MT[0(CK)，50(T1)，100 (T2)，200(T3)，300 μmol/L(T4)]处理对悬浮细胞生长、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Pro)含量、抗氧化酶活性的影响及T2处理冷响应相关的基因表达变化趋势。【结果】(1)在低温胁迫下，各MT处理悬浮细胞干重在培养周期内均呈先增加再减少最后趋于平稳或降低的趋势，在处理末期均明显高于CK。(2)各处理悬浮细胞MDA和Pro含量均随处理时间延长表现为先升后降，在24 h或48 h时达到峰值；各MT处理MDA含量均显著低于CK，Pro含量则显著高于CK，并均以T2处理最低或最高；(3)各MT处理细胞抗氧化酶活性均显著高于同期CK，并均以T2处理最高；随着时间延长，各处理的POD和CAT活性先升后降，SOD和APX活性则先降后升，且分别在24 h或6 h时达最高。(4)T2处理悬浮细胞冷响应相关基因(VvCBFs、VvICE1、VvRD29B和VvKIN-2)相对表达量在不同时间均较相应CK极显著上调。【结论】在低温胁迫下，适宜浓度(100 μmol/L)MT可通过提高葡萄悬浮细胞抗氧化酶活性和冷响应相关基因的相对表达量，增加Pro含量，降低MDA含量，最终增强葡萄悬浮细胞低温耐受性。
Abstract
[Objective] The study aims to analyze the effects of melatonin (MT) on the growth, biochemical characteristics, and expression of cold-responsive genes in grapevine (Vitis vinifera L.) suspension cells under low temperature stress, to screen the appropriate MT concentrations and to investigate the mechanism of MT in enhancing cold tolerance of grapevine. [Methods] Using ‘Pinot Noir’ grapevine suspension cells as test materials, we investigated the effects of different concentrations of MT [0 (CK), 50 (T1), 100 (T2), 200 (T3), 300 μmol/L (T4)] on the growth of the suspension cells, the content of malondialdehyde (MDA), the content of proline (Pro), and the antioxidant enzyme activities, and changes in gene expression related to cold response to T2 treatment, under low temperature (4 ℃) stress, [Results] (1) Under low temperature stress, the dry weight of cells in each MT treatment showed a trend of first increase then decrease, which was finally stable or decreased, and was higher than CK at the end of treatment. (2) MDA and Pro contents of each treatment were firstly increased and then decreased with the time of treatment, which reached the peak at 24 h or 48 h. MDA content of each MT treatment was lower than that of CK, while the Pro content was higher than that of CK, with T2 treatment being the lowest or the highest. (3) The antioxidant enzyme activities of each MT treatment were higher than that of CK, with T2 treatment being the highest. With the prolongation of time, the activities of POD and CAT of each treatment firstly rose and then fell, while the activities of SOD and APX firstly fell and then rose, which reached the highest at 24 h or 6 h, respectively. (4) The relative expression of cold-responsive genes (VvCBFs, VvICE1, VvRD29B, and VvKIN-2) in T2-treated suspension cells were up-regulated compared with CK. [Conclusion] Under low temperature stress, the appropriate concentration (100 μmol/L) of MT increases the expression of antioxidant enzymes and cold-response genes, increases Pro content, decreases MDA content, and enhances low temperature tolerance of grapevine suspension cells.
葡萄是中国重要的经济类果树，近年来其产量和品质频繁受到低温寒害的严重影响，从而给中国葡萄及葡萄酒产业的发展带来巨大挑战[1-2]。欧亚种葡萄是中国葡萄主栽品种，其原产于地中海气候地区，对中国北方大陆性气候适应性差，春季葡萄新梢、花及幼果等需预防“倒春寒”的伤害，冬季葡萄枝条需埋土防寒越冬[3]，但北方地区夏季光照充足，昼夜温差大，属于优质葡萄产区[4]。因此，提升葡萄抗寒能力，对葡萄及其相关产业的可持续发展具有重要意义[5]。
褪黑素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺，MT）是一种在生物体中广泛存在的吲哚胺类化合物，属植物内源性自由基清除剂，可有效清除超氧阴离子自由基（）、过氧化氢（H2O2）和单线态氧（1O2）等，具有很强的抗氧化性，能有效降低植物氧化损伤，增强植物的抗氧化能力和对逆境的抵御能力[6]。研究表明，MT能促进非生物胁迫下谷子[Setaria italica（L.）Beauv]、玉米（Zea mays L.）、棉花（Gossypium spp.）等农作物种子的萌发，增强其抗氧化性，抵御逆境胁迫对种子萌发的影响[7]。同时，MT在盐、干旱、温度等非生物胁迫中充当信号分子，可调节植物抗氧化系统，减少逆境对植物的损害[8-9]。低温胁迫会引起植物体内、H2O2、羟基自由基（-OH）和1O2等活性氧大量迸发而积累，植物细胞中活性氧（ROS）产生和清除的动态平衡遭到破坏，致使植物超氧化物歧化酶（SOD）和其他酶活性下降，同时产生过多的膜脂过氧化产物，破坏膜的完整性[10]，引起光合作用、呼吸作用、营养物质的转运等生理活动紊乱[11]。为防止ROS引起的氧化损伤和低温胁迫伤害，植物体内的过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等抗氧化酶活性增强，可以清除过量ROS，保护植物细胞免受氧化损伤[12]。外源MT可激活抗氧化酶活性，减少ROS积累和膜脂过氧化，从而降低低温胁迫对植物的伤害[13]；适宜浓度MT可通过提高油菜幼苗的SOD、POD活性，降低MDA含量，缓解低温胁迫的伤害[14]，也可以提高低温胁迫下番茄幼苗体内抗氧化酶的活性[15]；MT可参与并协助莱茵衣藻细胞对低温胁迫的保护响应活动[16]，缓解低温胁迫对降香黄檀幼苗生长状态的影响[17]。可见，MT可以通过提高抗氧化酶活性增强植物细胞对低温胁迫的耐受性。
另外，MT可通过调节CBF（C-repeat binding transcription factor）和ICE1（inducer of CBF expression）等冷响应基因的表达，促进抗冷化合物的合成，从而提高低温胁迫下拟南芥（Arabidopsis thaliana）、西瓜等植物的耐寒性[18]。CBF是AP2/EREBP转录因子家族在低温信号途径中发挥重要调控作用的关键转录因子之一[19]。ICE1是第1个被鉴定且研究最深入的CBF冷响应正调节因子，属于bHLH（basic helix-loop-helix）家族，可识别并结合到下游CBF基因启动子的MYC位点，激活CBF基因的表达，形成ICE1-CBF-COR调控网络，提高植物抵御低温胁迫的能力[20-21]。已有研究[22]发现，MT作为一种抗氧化剂和信号分子，在植物抵御低温胁迫中发挥重要作用，但作用机制尚未明确，对不同植物种类、器官、组织和细胞水平之间作用的差异性需要更深入研究。
迄今为止，国内外葡萄抗寒性研究主要以树体为对象，对葡萄悬浮细胞的研究甚少。葡萄的遗传转化效率低、周期长、工作量大且品种间差异大，导致很多研究采用拟南芥、番茄、烟草等模式植物进行基因功能验证。葡萄悬浮细胞的遗传转化效率高，周期短，且来源于葡萄的器官或组织，根据细胞全能性，它可被作为研究葡萄防御机制的可靠模型体系；与传统的植物材料相比，葡萄悬浮细胞具有分散性好、细胞团大小大致相同、均一性强、生长迅速、代谢快、重复性好、易于控制等优点，且比表面积大，颗粒度小，可以避免由于材料不均导致的试验误差。因此，本试验以葡萄悬浮细胞为试材，在低温胁迫下，通过考察不同时间不同MT浓度下葡萄悬浮细胞生长状态、生理指标、抗氧化酶活性以及VvCBFs、VvICE1、VvRD29B和VvKIN-2等冷响应相关基因表达水平的变化，筛选增强葡萄悬浮细胞耐低温能力的适宜MT浓度，为阐明MT增强葡萄抵御低温胁迫的机理提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料与处理
试验于2023年在甘肃农业大学园艺学院细胞培养实验室进行。以‘黑比诺’葡萄（Vitis vinifera L.， ‘Pinot Noir’）悬浮细胞为试验材料，接种于Gamborg B5[23]培养基中，附加20 g/L蔗糖，0.25 g/L水解酪蛋白（casein hydrolysate，CH），0.01 mg/L萘乙酸（1-naphthalen-eaceticacid，NAA）和0.02 mg/L激动素（kinetin，KT），pH值为6.0，置于摇床中，转速为110 r/min，28℃黑暗条件下培养，每7 d继代1次。
培养7 d的葡萄悬浮细胞经过滤后，称取4 g细胞置于20 mL B5液体培养基中，并分别添加50（T1），100（T2），200（T3），300 μmol/L（T4）的MT，以不添加MT处理悬浮细胞为对照（CK），进行不同时间（6，12，24，48，72 h）处理，置于摇床中，转速为110 r/min，4℃低温黑暗培养，每个处理设置3个生物学重复，按照处理时间收集细胞样品，并置于-80℃冰箱保存备用。
1.2 测定指标及方法
1.2.1 细胞生长曲线
收集培养0，3，5，7，10 d后葡萄悬浮细胞，并置于烘箱内烘至恒重，取出后称细胞干重，以细胞干重（mg）为纵坐标，培养时间（d）为横坐标，绘制细胞生长曲线。
1.2.2 生理生化指标
按照处理时间收集细胞样品进行生理生化指标测定，每个处理设置3个生物学重复。MDA含量参照陈建勋等[24]采用硫代巴比妥酸（thiobar bituricacid，TBA）显色法进行测定；脯氨酸（Pro）含量参照李合生[25]采用酸性茚三酮法测定；抗氧化酶活性的测定参照王学奎等[26]的方法并略作修改，SOD活性采用氮蓝四唑（NBT）法测定，POD活性采用愈创木酚法测定，CAT活性采用紫外分光光度法测定，APX活性采用乙二胺四乙酸法测定。
1.2.3 实时荧光定量PCR
利用 Trizol 试剂盒（Takara，大连）提取低温下CK和T2处理在4个时间点（3，6，12，24 h）葡萄悬浮细胞的RNA，以不添加MT处理且在正常条件下（25℃）生长的细胞为对照，经检测合格后采用试剂盒 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，大连）和 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TliRNaseH Plus）（Takara，大连）进行cDNA合成和qRT-PCR扩增。采用在线软件 Primer 3.0（http://primer3.ut.ee/）设计引物，以Actin为管家基因（表1）。
表1qRT-PCR 分析的引物序列
Table1Primer sequences for qRT-PCR analysis
将0.8 μg纯化的总RNA反转录成cDNA作为qRT-PCR的模板，定量PCR仪为Light Cycler® 96 Real-Time PCR System（Roche）；扩增总体系为20 μL，包括cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL、2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL、ddH2O 6 μL。反应程序：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环，试验进行3次生物学重复。反应结束后分析荧光值变化曲线及熔解曲线，并用计算基因相对表达量。
1.3 数据处理与分析
使用SPSS 25.0软件进行方差分析，通过Duncan检验方法进行多重比较，分析处理组间差异显著性，利用Origin 2018绘图。
2 结果与分析
2.1 不同浓度MT对低温胁迫下葡萄悬浮细胞生长曲线的影响
在4℃低温胁迫下，各浓度MT处理的葡萄悬浮细胞干重在培养周期内均呈先增加再减少最后趋于平稳或降低的趋势，基本呈S形曲线。在培养初期（0~3 d），所有处理悬浮细胞的生长都较为平缓，干物质增长量较小。其中，CK、T1和T4处理的细胞干物质增长速率均在第3—5天最大，第5天后增幅明显降低；CK和T1处理细胞干重均在第5天达顶峰，之后均呈下降趋势，而T4处理细胞干重在第7天达顶峰（339.50 mg），并显著高于其他处理。T2和T3处理细胞干重增长速率在第3—7天最大，T2处理细胞干重在第7天后开始下降，而T3处理细胞干重始终持续增加，在第10天达顶峰，并与T4处理接近（图1）。同一时间各浓度MT处理细胞干重在第3天均不同程度低于CK，在第5天T2和T3处理仍不同程度低于CK，在第7天以后均明显高于CK。以上结果说明外源MT处理能有效缓解低温胁迫对葡萄悬浮细胞生长的影响，且随着MT浓度增加，低温对悬浮细胞生长的影响减小。
2.2 不同浓度MT对低温胁迫下葡萄悬浮细胞MDA和Pro含量的影响
图2表明，随着低温胁迫时间的增加，不同浓度MT处理葡萄悬浮细胞中MDA含量呈先增加后降低的趋势，并均在48 h时达到顶峰；在相同处理时间下，各浓度MT处理的MDA含量均显著低于相应CK，且随着MT浓度的增加而先降后升，均在T2处理下达到最低值，并均与其余处理差异显著。
图1不同浓度MT处理对低温胁迫下葡萄悬浮细胞生长曲线的影响
Fig.1Effects of different melatonin concentrations on the growth of grapevine suspension cells under low temperature stress
图2低温胁迫下不同浓度MT处理对葡萄悬浮细胞MDA和Pro含量的影响
Fig.2Effects of different MT concentrations on MDA and Pro content in grapevine suspension cells under low temperature stress
同期不同小写字母表示处理间在0.05 水平存在显著性差异（P＜0.05）。下同。
Different lowercase letters within same time indicate significant differences among different treatments at 0.05 level (P＜0.05) . The same as below.
其中，在低温胁迫48 h时，T1、T2、T3、T4处理MDA含量分别比CK显著降低了18.1%、25.3%%、19.2%和20.4%，且除T1和T4处理外，其余MT处理间均存在显著性差异。可见，添加MT可以有效降低低温胁迫下葡萄悬浮细胞中的MDA含量，缓解低温胁迫对细胞膜透性的影响，且以T2处理效果最佳。
同时，随低温时间增加，各处理葡萄悬浮细胞中Pro含量均呈先增加后减少的趋势，CK和T4处理在低温24 h时达到峰值，其余处理均在低温48 h时达到峰值；在相同处理时间下，各浓度MT处理悬浮细胞Pro含量大多显著高于相应CK，且随MT浓度增加而先降后升，均在T2处理下达到最高值，并均与其余处理差异显著。其中，在低温处理48 h时，T1、T2、T3、T4处理悬浮细胞Pro含量分别比CK显著升高了15.2%、23.0%、14.7%和13.4%，且除T3和T4处理间相近外，其余MT处理间均存在显著性差异。因此，在低温胁迫条件下，添加MT可以有效提高葡萄悬浮细胞中Pro含量，且以T2处理的效果最好。
2.3 不同浓度MT对低温胁迫下葡萄悬浮细胞抗氧化酶活性的影响
各浓度MT处理葡萄悬浮细胞中SOD活性随着低温胁迫时间增加呈先降低后升高的趋势，并均在6 h时最高；在相同处理时间下，各浓度MT处理的SOD活性大多显著高于相应CK，且随MT浓度增加而先升后降，均在T2处理达到最高，并均与其余处理差异显著（图3）。其中，在低温胁迫12 h时，T1、T2、T3处理SOD活性分别比CK显著增加了23.2%、32.0%和21.5%，T4处理与CK无显著差异，且除T1和T3处理外，其余MT处理间均存在显著性差异。
随低温时间增加，各浓度MT处理葡萄悬浮细胞中POD活性均呈先增加后降低的趋势，并均在低温24 h时达到峰值；在相同处理时间下，各浓度MT处理悬浮细胞POD活性均显著高于同期CK，且随着MT浓度增加而先降后升，均在T2处理下达到最高值，并均与其余处理差异显著。其中，在低温处理24 h时，T1、T2、T3、T4处理悬浮细胞POD活性分别比CK显著升高了35.7%、41.5%、36.0%和36.5%，且除T1和T3处理间相近外，其余MT处理间均存在显著性差异。
随低温胁迫时间增加，各浓度MT处理葡萄悬浮细胞中CAT活性呈先升高再降低后升高的趋势，并均在6 h时最高；在相同处理时间下，各浓度MT处理的CAT活性均显著高于相应CK，且随着MT浓度增加而先降后升，均在T2处理下达到最高值，并均与其余处理差异显著。其中，在低温胁迫48 h时，T1、T2、T3、T4处理CAT活性分别比CK显著增加了13.7%、21.1%和11.7%和13.3%，且除T1和T4处理外，其余MT处理间均存在显著性差异。
图3低温胁迫下不同浓度MT处理对葡萄悬浮细胞抗氧化酶活性的影响
Fig.3Effects of different MT concentrations on antioxidant enzymes activity of grapevine suspension cells under low temperature stress
各浓度MT处理葡萄悬浮细胞中APX活性随着低温胁迫时间增加均呈先降低后升高的动态变化趋势，各处理均在低温6 h时达到峰值；在相同处理时间下，各浓度MT处理悬浮细胞均显著高于同期CK，且随着MT浓度升高先升高再降低，均在T2处理下达到最高值，并均与其余处理差异显著。其中，在低温处理6 h时，T1、T2、T3、T4处理悬浮细胞APX活性分别比CK显著升高了21.0%、36.5%、21.5%和32.1%，且除T1和T3处理间相近外，其余MT处理间均存在显著性差异。因此可见，适宜浓度的MT对低温胁迫葡萄悬浮细胞中SOD、POD、CAT和APX活性均具有显著促进作用，提高葡萄悬浮细胞的抗寒能力，且以T2处理效果最佳。
2.4 各浓度MT对葡萄悬浮细胞处理效应综合评价
在低温胁迫条件下，对不同浓度MT处理的葡萄悬浮细胞中6个指标进行主成分分析。提取特征值大于1的2个主成分，其方差贡献率分别为62.7%和25.1%，累积方差贡献率达到87.8%，符合要求。综合得分为每个主成分得分与相应贡献率乘积的和（表2），结果显示低温胁迫下葡萄悬浮细胞中各浓度MT处理的效应依次为: T2＞T3＞T4＞T1＞CK，这与细胞干重的表现基本一致。
表2各主成分得分及综合得分
Table2Principal component score and comprehensive score
图4葡萄悬浮细胞中各冷响应相关基因在不同低温胁迫时间的相对表达量
Fig.4Relative expression levels of cold-responsive genes of grapevine suspension cells at different time of low-temperature stress
2.5 T2处理下葡萄悬浮细胞中冷响应相关基因的表达分析
基于以上研究结果可知，T2处理能最有效缓解低温胁迫对葡萄悬浮细胞伤害，因此本研究利用qRT-PCR 分析T2处理下冷响应相关基因的表达情况，进一步从基因层面明确MT对葡萄细胞抵御低温胁迫的作用机制。结果（图4）表明：在低温胁迫条件下，各冷响应相关基因VvCBF、VvICE1、VvRD29B和VvKIN-2相对表达量随处理时间延长变化趋势不尽不同，但它们在不同时间处理下均为表现为上调表达，且均极显著高于CK。其中，在低温胁迫3 h时，VvCBF2、VvCBF3和VvICE1-b的相对表达量最大，分别是同期CK的2 073倍、128倍和72倍；在低温胁迫6 h时，VvCBF1和VvCBF4的相对表达量最高，分别是同期CK的223倍和253倍；在低温胁迫12 h后，VvICE1-a和VvKIN-2的相对表达量达到顶峰，分别是同期CK的134倍和97倍；在低温胁迫24 h时，VvICE1-c和VvRD29B的相对表达量最高，分别为同期CK的404倍和490倍。可见，MT处理能极显著提高低温胁迫下葡萄悬浮细胞中与低温相关的转录因子基因VvCBF、VvICE1、VvRD29B和VvKIN-2的相对表达量。
2.6 T2处理葡萄悬浮细胞各指标和基因表达量的相关性分析
T2处理下生理各指标和冷响应相关基因表达量的相关性分析结果（图5）表明：葡萄悬浮细胞中的MDA、Pro含量和SOD、POD、CAT、APX活性与CBFs、ICE1、RD29B、KIN-2基因表达量之间存在一定的关联关系。其中，CBF1、CBF4、ICE1-a、RD29B表达量与MDA、Pro含量和SOD、POD活性呈极显著正相关，KIN-2表达量与APX活性呈显著正相关，CBF3表达量与CAT活性呈正相关；CBF1表达量与APX活性呈显著负相关，ICE1-b表达量与CAT活性呈极显著负相关。因此，在低温胁迫下，T2浓度MT处理下葡萄悬浮细胞中的各生理指标与冷响应相关基因共同影响着其对低温胁迫的应答和抵御能力。
图5低温胁迫下T2处理葡萄悬浮细胞各生理指标与基因表达的相关性分析
Fig.5Correlation analysis between various physiological indicators and gene expression levels in grapevine suspension cells under T2 treatment
蓝色表示负相关性，红色表示正相关性，*和**分别表示在P≤0.05和P≤0.01水平相关性显著。 MDA.丙二醛；Pro.脯氨酸；SOD.超氧化物歧化酶；POD.过氧化物酶；CAT.过氧化氢酶；APX.抗坏血酸过氧化物酶。
Blue indicates negative correlation, while red indicates positive correlation. * and ** indicate significant correlation at the P≤0.05 and P≤0.01 level, respectively. MDA, malondialdehyde. Pro, proline. SOD, superoxide dismutase.POD, peroxidase. CAT, hydrogen peroxidase. APX, ascorbate peroxidase.
3 讨论
当植物遭受低温胁迫后，细胞膜的流动性降低且酶活力下降，体内活性氧的产生和清除的平衡被破坏，导致细胞代谢紊乱，植物的正常生长受到严重影响[27]。本研究中，低温胁迫下添加MT的葡萄悬浮细胞干物质积累量在处理末期显著高于CK；且随着MT浓度增加，低温对悬浮细胞干物质积累的影响越小，这说明MT发挥了抗氧化剂的功能，缓解了低温胁迫对葡萄悬浮细胞的氧化伤害，降低了氧化胁迫对细胞生长的影响，提高了葡萄细胞干物质的积累，这与赵海亮等[28]关于MT缓解低温胁迫对番茄（Solanum lycopersicum L.）生长的研究结果相似。
膜脂过氧化的最终产物MDA是衡量植物耐受低温的一个重要指标，其含量越高，细胞膜受损越严重，植物耐低温胁迫能力越差[29]。本研究添加MT的葡萄悬浮细胞中MDA含量均显著低于CK，且随着处理时间和MT浓度的增加，MDA含量呈降低趋势，这表明MT可缓解低温对葡萄悬浮细胞膜脂过氧化的损伤程度，显著抑制细胞中MDA的产生，这与史中飞[30]关于MT处理减少低温胁迫下黄瓜（Cucumis sativus L.）MDA积累的结果相一致；在本研究相同低温胁迫时间下，随MT浓度增加MDA含量呈先升高后降低的趋势，且T2处理中MDA积累量显著低于其他处理，由此推测100 μmol/L MT处理葡萄悬浮细胞耐低温能力最强。同时，Pro是植物体内最有效的一种亲和性渗透调节物质，其大量积累可有效提高植物对低温胁迫的耐受性[31]。本研究中添加MT后葡萄悬浮细胞中Pro含量在不同处理时间下均显著高于CK，并随低温处理时间增加呈先升高后下降的趋势，且T2处理的Pro含量显著高于其他处理。这说明外源MT能显著提高葡萄悬浮细胞中Pro的含量，且适宜浓度的MT更有利于葡萄细胞内Pro积累，这与刘定豪等MT缓解植物非生物胁迫的研究结果[32]相一致，这进一步说明了在低温胁迫下MT能通过提高细胞的抗氧化能力，保持细胞膜的完整性，增强葡萄悬浮细胞对低温的耐受性。
在低温胁迫下，SOD、POD、CAT、APX作为植物抵御低温胁迫的第二道防线，保护细胞免受氧化损伤[33]。本研究中不同浓度MT处理均提高了葡萄悬浮细胞中SOD、POD、CAT、APX等抗氧化酶的活性，这与李欠敏等关于MT对低温胁迫下大白菜的生理特性影响的研究结果[34]一致，外源MT处理可通过增强低温胁迫下植物中抗氧化酶活性来维持细胞膜结构的稳定性，从而提高植物抵御冷害的能力。另外，随MT浓度增加，同一处理时间下葡萄悬浮SOD、POD、CAT、APX活性呈不同的动态变化趋势，且T2处理的SOD、POD、CAT和APX活性均显著高于其他浓度处理和CK，推测可能是由于适宜浓度（100 μmol/L）的MT更有利于增强细胞抗氧化系统中酶活性以减少ROS的积累，从而缓解氧化损伤；而高浓度（200，300 μmol/L）的MT反而会增加ROS的积累，加剧低温胁迫对葡萄悬浮细胞造成的氧化损伤，这与Ou等[35]认为低浓度MT促进低温胁迫下侧柏抗氧化酶的活性，反之高浓度抑制相关酶活性的结果相似；但与Zhao等[36]的研究结果1.0 mmol/L MT降低抗氧化酶活性，3.0 mmol/L MT增加了抗氧化酶活性的结果不同，推测这可能是由于植物材料、处理方法和胁迫类型等因素的不同而造成的差异。
另外，在低温胁迫下，冷响应相关基因的表达是提高植物抗寒性的重要因素，研究发现MT可以提高拟南芥、烟草（Nicotiana tabacum L.）、水稻（Oryza sativa L.）等植物中CBF、DREB、ICE、COR15a、钙调蛋白结合转录激活因子1（CAMTA1）等与冷响应通路相关基因的表达[37-38]。本研究中T2处理显著提高了葡萄悬浮细胞中VvCBFs、VvRD29B和VvKIN-2等冷响应基因的相对表达量，且相同处理下这些转录因子基因（VvCBF1、VvCBF4、VvICE1-a、VvRD29B）的表达与其MDA、Pro含量及SOD和POD活性呈极显著正相关。这进一步说明了外源MT不仅可以提高葡萄悬浮细胞中抗氧化系统酶活性及增加Pro等渗透调节物质的积累，还可以促进冷响应相关基因的表达。综上，MT可以通过对生理生化特性影响及基因表达调控共同提高葡萄悬浮细胞抵御低温胁迫的能力。
4 结论
低温胁迫下，不同浓度外源MT可以提高葡萄悬浮细胞干物质积累，缓解低温对细胞生长的影响。还可以通过提高细胞中Pro的积累、抗氧化酶系统相关酶活性和降低MDA含量，缓解低温胁迫对葡萄细胞的氧化损伤，并以100 μmol/L MT处理的效果最为显著。此外，低温胁迫下葡萄悬浮细胞中VvCBFs、VvRD29B和VvKIN-2等冷响应基因的相对表达量在MT处理下均表现为上调表达，且极显著高于CK，出现峰值的时间也不同。因此，外源MT可以提高低温胁迫下葡萄细胞抗氧化能力及冷响应相关基因的表达，以此增加葡萄悬浮细胞抵御低温胁迫的能力。
