短柄五加叶黄酮抑菌活性及对洋葱的化感效应
doi: 10.7606/j.issn.1000-4025.20240095
杨建霞1,2 ， 范小峰1,2 ， 邵姜伟2 ， 颜浩2
1. 甘肃省陇东生物资源保护利用与生态修复重点实验室，甘肃庆阳 745000
2. 陇东学院 生命科学与技术学院，甘肃庆阳 745000
基金项目: 甘肃省自然科学基金项目(21JR1RM328) ； 兰州大学“细胞活动与逆境适应教育部重点实验室”开放基金项目(lzujbky-2020-kb05) ； 陇东学院青年科技创新项目博士研究专项(XYBE1602) ； 甘肃省陇东生物资源保护利用与生态修复重点实验室项目
Antibacterial activity of the flavonoid extracts from Eleutherococcus brachypus leaves and the allelopathic effects on Allium cepa
YANG Jianxia1,2 ， FAN Xiaofeng1,2 ， SHAO Jiangwei2 ， YAN Hao2
1. Key Laboratory for Protection and Utilization of Longdong Bio-resources in Gansu Province, Qingyang, Gansu 745000 , China
2. College of Life Science and Technology, Longdong University, Qingyang, Gansu 745000 , China
摘要
【目的】 探讨短柄五加叶黄酮提取物的抑菌活性及其化感作用，为开发抗菌剂及利用其化感作用进行植物保护和农业生产等提供依据。【方法】以短柄五加叶为材料，采用超声波辅助提取叶黄酮，测定不同浓度(100%、50%、25%)的叶黄酮提取液胁迫下抑菌圈直径、最小抑菌浓度(MIC)，洋葱鳞片表皮细胞凋亡率、丙二醛(MDA)、H2O2含量、抗氧化酶活性及根和芽生长抑制率。【结果】(1)超声波辅助提取的叶黄酮得率为42.3 mg/g。(2)在相同浓度下，抑菌圈直径依次为金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞沙门氏菌，且在同一菌种内随着提取液浓度增加而扩大，MIC值也依次为金黄色葡萄球菌＜枯草芽孢杆菌＜沙门氏菌。(3)各浓度叶黄酮提取液均能诱导洋葱鳞片叶表皮细胞凋亡，且在相同处理时间内细胞凋亡率、MDA、H2O2含量也随处理液浓度升高而增加，POD、CAT活性则随处理液浓度增加呈先升后降，均显著高于对照。(4)不同浓度叶黄酮提取物液均能抑制洋葱根、芽的生长，且抑制率具有浓度依赖性。【结论】短柄五加叶黄酮提取物对革兰氏阳性菌的抑菌效果显著优于对革兰氏阴性菌，且抑菌效果与提取液浓度呈正相关，可能通过诱导产生过量H2O2和抑制抗氧化酶活性，导致膜脂过氧化损伤和细胞死亡，抑制洋葱根、芽生长。
Abstract
[Objective] The study aims to explore the antibacterial activity and allelopathy of flavonoids from leaves of Eleutherococcus brachypus, and to provide the basis for the development of plant-derived antimicrobial agents and the application of their allelopathy in plant protection and agricultural production. [Methods] Leaf flavonoids was extracted by an ultrasonic-assisted method from E. brachypus leaves, then the antibacterial sphere, the minimum inhibitory concentration (MIC), the apoptosis rate, MDA content, ROS content, and the activity of antioxidant enzymes of epidermal cells from onion scaly leaves, as well as the inhibitory rate of the onion root and shoot growth were determined with different concentrations of leaf flavonoid extracts (100%, 50%, and 25%). [Results] (1) The yield of leaf flavonoids from E. brachypus was 42.3 mg/g. (2) At same concentration, the diameter of the inhibition zone was S. aureus ＞ B. subtilis ＞ Salmonella, respectively, and expanded with the increase in the extract concentrations with the same strain. The minimum inhibitory concentration of the three strains was also S. aureus ＜ B. subtilis ＜ Salmonella, respectively. (3) Each concentration of leaf flavonoids from E. brachypus induced apoptosis in the upper epidermal cells of Allium cepa. Meanwhile, as the concentration of flavonoid extracts increased, the apoptosis rate, MDA content, and H2O2 content were increased. POD activity and CAT activity were increased first and then decreased during the same time of treatment, which were higher in treatment groups than the control. (4) The growth of root and shoot of the onion scale leaves were inhibited under the treatment of flavonoids extracts, which was negatively correlated with the treatment dose. [Conclusion] The antibacterial effects of the leaf flavonoid extracts of E. brachypus on Gram-positive bacteria are better than that of Gram-negative bacteria, and the antibacterial effects are positively correlated with the concentration of flavonoid extracts. Moreover, all these changes suggest that the allelopathic mechanism of flavonoid extracts from E. brachypus may be due to the overproduction of ROS and the inhibition of antioxidant enzyme activity, which cause oxidative damage to membrane lipids and cell death.
短柄五加（Eleutherococcus brachypus）是五加属刺五加组的多年生落叶小灌木，在中国的分布范围极其狭窄，主要分布于西北黄土高原甘肃、宁夏、陕西一带，在甘肃主要分布于庆阳、平凉、陇南、临夏、甘南以及甘肃子午岭一带的正宁等地，是中国特有的濒危植物[1]。据《中国药典》和《本草纲目》中记载，短柄五加药用历史悠久，且通常以五加皮入药。现代药理学研究发现短柄五加含有黄酮、皂苷、酚酸、木质素、挥发油等许多重要的天然活性成分[2-3]，具有治疗神经衰弱、妇女更年期综合症、继发性高血压、白细胞减少等功效[3-4]。近年来，由于过度放牧或无限制的长期采挖短柄五加根、茎，造成了其野生资源的急剧下降[1]。目前短柄五加药材的质量控制多以总黄酮为依据[5]，许多研究表明黄酮类化合物在抗肿瘤、抗氧化、提高机体免疫力方面有显著的药理活性[6-10]。虽已有人对短柄五加提取物的抑菌活性进行了研究，但大都集中在根或茎皮的提取物上[3，8]。目前有研究发现短柄五加叶片中黄酮含量高于其他部位[5]，但对其叶提取物的抑菌活性和细胞毒性鲜见研究。
细胞程序性死亡（PCD）或细胞凋亡是植物生长发育、细胞分化及病理反应过程中细胞主动、有序的死亡过程，与动物细胞凋亡的形态、生化特征，甚至分子水平上有许多相似之处[10-11]。植物细胞凋亡研究中国虽起步较晚，但短短十几年内进展十分迅速[12-14]。研究发现细胞凋亡除在植物正常生长发育过程中普遍存在外，还会在植物遭受各种生物或非生物胁迫时触发细胞凋亡。利用NaCl、CaCl2、H2O2、FeSO4、Cd2+等化学因子诱导植物PCD的研究已被多次报道[15-18]，也有学者将植物提取物如黄酮、皂苷、多酚等用于诱导动物细胞凋亡或抗癌等研究[11，19-20]，但将短柄五加叶黄酮进行抑菌活性和化感胁迫诱导植物细胞凋亡及抑制根、茎生长的研究则较少。
化感作用是一种植物与植物之间的互作现象，也是植物之间最古老的化学语言，其中一种植物释放出具有生物活性的化合物，会对目标植物的适应性产生负面影响[21]。化感作用与细胞死亡有密不可分的关系，有研究称植物遭受生物或非生物胁迫，轻则引起PCD，重则引起细胞坏死[15]。在细胞水平上，化感物质能够诱导目标植物中ROS爆发，引起氧化应激反应，并促进PCD[21]。前期研究发现短柄五加不同部位取材的水浸提液（煎煮法）在诱导洋葱表皮细胞凋亡方面存在明显的差异，其中叶片水浸提液诱导细胞凋亡现象远比其他部位剧烈。因此，本研究拟以短柄五加叶黄酮提取物为材料，进行抑菌活性及洋葱鳞片叶表皮细胞和根、芽生长的细胞毒性检测，旨在探讨叶黄酮提取物的抑菌活性和化感物质细胞毒性分子机理，为短柄五加叶黄酮植物源抗菌剂开发，以及合理利用其植物毒性在农业生产上减轻连作障碍和减少农药投放等方面提供参考。
1 材料和方法
1.1 试验材料
短柄五加叶片于2023年5月下旬采摘自陇东学院生农科技园，经陇东学院生命科学与技术学院马世荣副教授鉴定系野生短柄五加。挑拣采集的叶片，去除枯叶、烂叶，于真空干燥箱中60℃干燥，粉碎，40目过筛后，分装于自封袋，-20℃冷藏备用；金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、沙门氏菌（Salmonella）均为陇东学院生命科学与技术学院微生物实验室保存，活化后备用。
1.2 仪器及试剂
试验试剂：95%乙醇、石油醚、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、苯酚等药品均为化学纯，购自庆阳市化工总汇门店；没食子酸、芦丁标准品，DAB免疫组织化学显色试剂盒、过氧化氢（H2O2）含量检测试剂盒（比色法）等购自上海生工；卡宝品红染色液为实验室自配。
试验仪器：植物粉碎机（FZ-102，广州市大祥电子机械设备有限公司）、生化培养箱（LRH-250A，江苏新春兰科学仪器有限公司）、数控超声波清洗器（KQ-250DB，昆山市超声仪器有限公司）、台式高速冷冻离心机（HR/T16M，湖南赫西仪器装备公司）、紫外-分光光度计（UV-5100B，上海元析仪器有限公司）、超净工作台（单人双面SW-CJ-IF，苏州苏洁净化设备公司）、真空冷冻干燥机（DZF-605，上海海向仪器设备厂）、高压蒸汽灭菌锅（LS-36HD，江阴滨江医疗设备有限公司）、旋转蒸发仪（R-201，上海申胜生物技术有限公司）、微波萃取仪（H-100A，北京祥鹄科技发展有限公司）等。
1.3 试验方法
1.3.1 短柄五加叶总黄酮的提取及含量测定
参照刘瑞雪[11]的方法并略作修改。准确称取烘干冷藏的短柄五加叶粗粉100 g，用70%乙醇浸泡24 h，将三角瓶置于超声波清洗器中，在功率180 W、温度70℃、料液比1∶10条件下振荡提取2.5 h（根据前期实验优化的提取条件），之后将提取液离心、过滤、浓缩、冷冻干燥，得干燥叶粗提物，供检测使用。
以芦丁为标准品，采用硝酸铝显色法[5]，用紫外-可见分光光度计测定并绘制芦丁标准曲线，得回归方程为y=8.5371x+0.0096（R2=0.992 8），并据此计算供试样品中总黄酮含量为42.3 mg/g。提取率=（C×稀释倍数×V）/m×1000。式中：C为待测样品中黄酮浓度（mg/mL）；V为样品提取液定容体积；m为干燥叶粗提物质量。
1.3.2 叶粗提物中总黄酮鉴定
采用盐酸-镁粉反应鉴定叶粗提物中黄酮类化合物[22]。取少量1.3.1节中叶粗提物溶于1 mL乙醇中，加入少许镁粉振荡摇匀，再滴加几滴浓盐酸，观察1~2 min内显红色或紫红色，则证明叶粗提物中有效成分为黄酮类化合物。
1.3.3 抑菌性试验
（1）菌悬液制备[10]：将金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌用划线法接种在NA培养基中，在37℃恒温箱中活化培养24 h，取出置于4℃冰箱中备用。将菌种复苏后，接种至NA固体培养基上，28℃培养24 h，统计菌落数，用灭菌的无菌水稀释菌悬液，调整细胞个数至1×108 CFU/mL（OD625值在0.08~0.10之间），备用。
（2）滤纸片法测定抑菌圈直径[7]：将叶黄酮提取物用1 mL pH为7.4的PBS溶液充分混匀即为100%原液，再用PBS按照原液2倍稀释梯度配制50%原液和25%原液。将灭菌的圆形滤纸片（直径1 cm）分别在不同浓度的叶粗提液（100%、50%、25%提取液）中充分浸泡30 min，置于接种过菌株的培养基表面，每个培养皿放入3个处理过的滤纸片，且每组3个重复，以PBS浸泡过的滤纸片作对照，于37℃恒温培养箱培养24 h，取出后测量抑菌圈直径。
（3）最低抑菌浓度（MIC）测定[10]：采用2倍肉汤稀释法，使用96孔板，将叶黄酮提取物用LB液体培养基进行倍比稀释，得到质量浓度梯度分别为42，21，10.5，5.25，2.63，1.31，0.66，0.33，0.17，0.085 mg/mL 的样品。先在每一微孔中分别添加3种菌悬液各150 μL，再分别依次添加上述稀释的不同浓度叶黄酮提取液各50 μL作为实验组，接种菌悬液的LB培养基的微孔作为阳性对照组。37℃培养24 h，观察菌液生长情况，菌液透明澄清时所对应的最小浓度即MIC，重复测定3次，取平均值。
1.3.4 短柄五加叶黄酮提取液对洋葱鳞片叶表皮细胞凋亡的影响
（1）形态学观察[16]：取新鲜洋葱在室温下于清水中培养24 h，使其活化。将活化后的洋葱鳞片叶内表皮切取1 cm2左右的表皮组织若干，分别将不同浓度叶黄酮提取液（100%、50%、25%稀释液）分别处理1 h、2 h及4 h，以PBS处理组作对照，再经卡宝品红染色液染色15 min后压片、镜检，比较各处理组细胞形态及细胞核染色变化，并拍照记录结果，剩余的洋葱鳞茎用不同浓度叶黄酮提取液继续处理，在室温下培养7 d后测量根、芽的生长情况（方法参见1.3.5节），每组重复3次。
（2）凋亡细胞计数：将不同浓度叶黄酮粗提液处理组和对照组的洋葱鳞片叶内表皮组织随机选取5个视野[16]，统计总洋葱内皮细胞数和凋亡细胞数（以细胞核染色质出现明显的边缘化、凝集和胞质小泡为标志），计算细胞凋亡率[（凋亡细胞数/总细胞数）×100%]。
（3）丙二醛（MDA）含量测定：各组处理结束后，随机称取上述各处理组洋葱鳞片叶组织0.5 g，置于研钵中冰浴研磨、匀浆后，转入10 mL离心管，加入5 mL 10%三氯乙酸（TCA）溶液混匀，4 000 r/min离心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL 0.6%的TCA溶液，混匀，沸水浴15 min后，迅速在冷水中冷却，然后4 000 r/min 离心10 min，取上清液即为MDA提取液，用硫代巴比妥酸显色法测定MDA含量[17]。其中，叶黄酮提取液处理2 h的MDA含量变化最大，后续试验提取液处理时间均采用2 h。
（4）抗氧化酶活性测定：各组叶黄酮提取液处理2 h后，用蒸馏水洗净洋葱鳞片上残留处理液，剪成0.5 cm×0.5 cm大小方块，每处理称取1 g，加10 mL预冷的pH为7.8 PBS（50 mmol/L）缓冲液在冰浴上研磨，在4℃条件下10 000 r/min离心15 min，上清液为粗酶液。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑法测定，过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚比色法测定，过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外吸收法测定，以上均参照李小方等[17]所描述的方法，每个处理测量3次。
（5）H2O2的原位观察及含量测定：采用DAB免疫组织化学显色试剂盒检测，按照试剂供应商说明书检测叶黄酮提取液处理2 h的洋葱表皮组织，待显色3~30 min（显微镜观察显色情况）后，用蒸馏水终止DAB反应，制作临时性装片，于倒置显微镜下镜检、拍照。同时，在各组叶黄酮提取液处理2 h后，称取1 g洋葱鳞片叶，加入2 mL丙酮进行冰浴匀浆，8 000g、4℃下离心10 min，取上清液，置于冰上待测。采用过氧化氢（H2O2）含量检测试剂盒（比色法）按照试剂供应商操作说明书加入试剂，用蒸馏水调零，用紫外-分光光度计在波长415 nm下测定吸光度值D415，并计算H2O2含量。
1.3.5 短柄五加叶黄酮提液对洋葱根和芽生长抑制率的影响
将活化后生长状况良好的洋葱鳞茎置于分别添加100%、50%、25%叶黄酮浸提液稀释液的烧杯中，在25℃的光照培养箱中，于16 h/8 h的光照条件下培养7 d，以pH为7.4的PBS溶液处理作对照，每组设3个重复，每隔1 d换1次处理溶液，每天上午8:00—9:00向烧杯中加入相应浓度的叶黄酮稀释液10 mL，以补充每天烧杯中处理液的蒸发量[18]，待7 d后拍照记录洋葱根、芽生长情况，用ImageJ软件测量根、芽长度，并计算根长、芽长抑制率（R）。
R=1-LE/LC×100%
式中：LE为处理组的根长、芽长；LC为对照组的根长、芽长。
1.3.6 数据统计与分析
采用Excel 2019和SPSS 20.0软件对数据进行统计分析、单因素方差分析，并用LSR法进行多重比较和Duncan法进行显著差异性检验，Excel 2019软件作图，数据为平均值±标准差。
2 结果与分析
2.1 短柄五加叶黄酮提取液对3种细菌的抑制活性
由图1可知，在相同浓度叶黄酮提取液处理下，3种供试菌抑菌圈直径均表现为金黄葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞沙门氏菌，而同一供试菌抑菌圈直径则随着提取液浓度降低而显著减小，但均显著大于对照。其中，100%提取液（E100）的抑菌效果最强，对金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌的抑菌圈直径分别为24.4，22.1，18.3 mm。说明短柄五加叶黄酮提取液对不同供试细菌的抑菌效果存在差异，表现为金黄色葡萄球菌＞枯草杆菌＞沙门氏菌，且抑菌效果与其浓度呈正相关趋势。
图1不同浓度短柄五加叶黄酮提取液对3种菌株的抑菌效应比较
Fig.1Comparison of antibacterial effects of different concentrations of leaf flavonoids extracts from E. brachypus on three kinds of bacteria
CK为PBS处理，而E25、E50、E100分别为25%、50%、 100%提取液处理。同一菌内不同小写字母代表叶黄酮提取液处理间差异显著（P＜0.05）。
CK indicates PBS treatment, while E25, E50, and E100 represent treatments with 25%, 50%, and 100% leaf flavonoids extracts, respectively. Different lowercase letters in the same bacteria indicate significant difference among flavonoid extract treatments (P＜0.05) .
由表1可知，叶黄酮提取液对沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为5.25，2.63，1.31 mg/mL，这与抑菌圈直径的观测结果一致，表明2种革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）对短柄五加叶黄酮提取液的抗菌性更敏感，且金黄色葡萄球菌的敏感性略大于枯草芽孢杆菌，这也与抑菌圈的表现一致。这可能与革兰氏阴性细菌（沙门氏菌）细胞表面脂多糖结构的差异有关，也与其对黄酮抗菌活性的敏感性有关[7]。
2.2 短柄五加叶黄酮提取液对洋葱鳞片叶表皮细胞凋亡的影响
显微观察结果（图2）显示，在未处理的阴性对照组（PBS处理）中（图2，A），洋葱鳞片叶表皮细胞膜完整，细胞核呈球形或椭圆形、染色均匀，细胞质均匀透明。在不同浓度的叶黄酮提取液（E100、E50、E25）处理洋葱鳞片叶表皮细胞2 h后，细胞膜皱缩，细胞质高度浓缩（图2，B）；经卡宝品红染液染色后可见到许多颗粒状物体散布于核内，并出现明显的深染色区域，凋亡细胞核形状改变，核染色质凝集、趋边化，可以明显观察到液泡膜破裂，细胞质崩解、破裂，形成许多胞质小泡（图2，C中黑色箭头所示）；随着细胞质逐渐崩解，细胞核似乎完全被“挤”出胞质体外，并进一步皱缩、变形（图2，D中白色箭头所示），且凋亡现象随提取液浓度的增加而呈加剧趋势。进一步统计细胞凋亡率（图2，E）发现，各处理组细胞凋亡率与PBS对照组（凋亡率4.3%）相比均有显著差异，且随着叶黄酮提取液浓度增加而升高，在E100处理中凋亡率达到最大（54%）。其中，E25处理细胞凋亡率与E50、E100处理间也存在显著差异，而E50与E100处理间则差异不显著。
表1短柄五加叶黄酮提取液对3种供试菌的最低抑菌浓度
Table1The minimum inhibitory concentration (MIC) of leaf flavonoid extracts from E. brachypus against three kinds of bacteria
注：“-”表示无菌生长，“+”表示有菌生长，“++”表示有大量菌生长。
Note: “-” means having no bacterial growth, “+”-means having bacterial growth, and “++” means having a large number of bacterial growth.
图2不同浓度短柄五加叶黄酮提取液对洋葱鳞片内表皮细胞的凋亡诱导作用
Fig.2Apoptosis-inducing effects of different concentrations of leaf flavonoid extracts from E. brachypus on epidermal cells of A. cepa
A.CK，PBS处理；B.E25处理；C.E50处理，黑色箭头指凋亡细胞中的胞质小泡；D.E100处理，白色箭头指凋亡细胞核染色质固缩化；E.细胞凋亡率。不同小写字母表示处理间在0.05水平差异显著。下同。A-D均为显微镜下40×放大图片。
A. CK, PBS treatment. B.25% leaf flavonoid extracts. C.50% leaf flavonoid extracts, the black arrow indicates the cytoplasmic vesicles in apoptotic cells. D.100% leaf flavonoid extracts, the white arrow indicates the chromatin condensation in apoptotic nuclei. E. Apoptosis rate. Different lowercase letters indicate significant differences among flavonoid extract treatments at 0.05 level (P＜0.05) . The same as below. A-D show the40× magnification images.
2.3 叶黄酮提取液对洋葱鳞片叶中MDA、ROS含量及抗氧酶活性的影响
如图3所示，在相同处理时间内，洋葱鳞片表皮细胞内MDA含量随叶黄酮提取液浓度的增大逐渐升高，各组叶黄酮提取液处理间均差异显著，且它们均高于同期对照（PBS）；在相同提取液浓度下，各组处理洋葱鳞片表皮细胞内MDA含量均以处理2 h后最高，处理4 h时反而有降低趋势，在处理1 h时最低。即叶黄酮提取液诱导洋葱鳞片叶表皮细胞内MDA积累量并没有随时间增加而逐渐升高，暗示植物对胁迫因子可能有一定的适应性，也初步说明叶黄酮可能通过诱导洋葱鳞片叶表皮细胞内MDA积累造成膜脂过氧化，进而触发细胞凋亡。
图3不同时间不同浓度叶黄酮提取液处理下洋葱鳞片叶表皮细胞中MDA含量
Fig.3The MDA content in epidermal cells of A. cepa at different time and under the treatment of different concentrations of leaf flavonoid extracts from E. brachypus
H2O2是一种重要的活性氧（ROS），主要参与细胞代谢的调节[23]，通过对H2O2积累量的定量分析，可确定短柄五加叶黄酮提取液对洋葱鳞片叶中ROS积累的影响。H2O2原位观察显示（图4），阴性对照组中洋葱表皮细胞呈现较弱的褐色（图4，A），而叶黄酮提取液处理组中，DAB染色显示褐色主要分布在细胞膜与细胞壁之间（4，B-D），且随着处理液浓度升高DAB染色逐渐加深，说明H2O2积累量也逐渐增多，表明叶黄酮提取液处理能够诱导洋葱鳞片叶内ROS水平升高。植物可通过抗氧化酶系统清除体内多余的ROS，从而降低逆境胁迫对植物的影响。POD和CAT是抗氧化酶系统中控制植物体内ROS积累最主要的酶，同时也对植物的健康生长起至关重要的保护作用[24]。由表2可知，在叶黄酮提取液胁迫处理2 h后，随着提取液浓度增大，洋葱鳞片叶中H2O2含量显著升高，且H2O2含量与叶黄酮提取液浓度呈正相关，并与DAB原位观察结果一致（图4，B-D）；而与此同时洋葱鳞片叶中POD和CAT活性表现出先升后降的趋势，且各提取液处理组均显著高于CK组，SOD活性虽也不同程度高于对照，但各处理组间差异不显著。这暗示叶黄酮提取液能够诱导洋葱鳞片叶中ROS分子积累，对抗氧化物酶活性表现为低促高抑，因而会削弱其对细胞内ROS的清除，最终引起细胞氧化性损伤，触发细胞凋亡甚至死亡。
图4不同浓度叶黄酮提取液处理下洋葱鳞片叶表皮细胞内ROS的分布原位观察（40×）
Fig.4In situ distribution of ROS in epidermal cells of onion scale leaves under the treatment of different concentrations of leaf flavonoid extracts (40×)
A—D分别对应对照组及25%、50%和100%的叶黄酮提取液处理2 h后经DAB染色表皮细胞。
A, B, C, and D represent epidermal cells correspond to the control group and treated with 25%, 50%, and 100% leaf flavonoids extracts concentration after two hours, then stained by DAB, respectively.
表2不同浓度叶黄酮提取液处理下洋葱鳞片叶表皮细胞中H2O2含量及抗氧化酶活性
Table2H2O2 content and antioxidant enzyme activity in epidermal cells of A. cepa under different concentrations of leaf flavonoid extract treatments from E. brachypus
注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
Note: The different lowercase letters within same column indicate significant difference among treatments at 0.05 level (P＜0.05) .
2.4 不同浓度叶黄酮提取液对洋葱根、芽生长的化感胁迫
图5表明，不同浓度叶黄酮提取液处理均能够显著抑制洋葱根和芽生长。其中，E25、E50和E100处理对洋葱芽长的抑制率分别达26%，47%，56%，而对根长的抑制率则分别达44%，54%，57%；洋葱芽长和根长在E25、E50、E100处理下均显著低于相应对照，芽长在E50、E100处理下显著低于E25处理，但前两者间无显著差异，而根长在E25、E50、E100处理间均无显著差异。说明叶黄酮提取液对洋葱根生长抑制的程度始终比芽的剧烈，进而表明短柄五加叶黄酮提取液对洋葱根、芽的生长抑制很有可能通过其化感物质的植物毒性发挥作用。
图5短柄五加叶黄酮提取液对洋葱根、芽生长的影响
Fig.5Allelopathic effects of leaf flavonoid extracts from E. brachypus on root and shoot growth of A. cepa
3 讨论
植物中黄酮类成分具有广谱的药理活性，如抗氧化、抗自由基、降糖、抗肿瘤、抗心血管疾病、抑菌、免疫调节等[3，5-9]，由于其药理作用背后潜在的巨大经济和社会价值，已成为国内外天然药物领域以及保健品行业开发利用研究的热点。研究发现，竹叶黄酮对大肠杆菌有较好的抑菌能力[3]，红柳不同部位黄酮提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌均有一定的抑菌活性[8]，迷迭香加工残渣中活性物质黄酮对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）有明显的抑制作用，对革兰氏阴性菌（沙门氏菌和大肠杆菌）无明显抑制效果[10]。本研究发现短柄五加叶黄酮提取液在相同处理浓度下对3种供试细菌的抑菌圈直径依次为金黄葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞沙门氏菌，且对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌的MIC分别为1.31，2.63，5.25 mg/mL，MIC值与抑菌圈直径表现一致，表明叶黄酮提取液对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）的抑菌效果均优于革兰氏阴性菌（沙门氏菌），这可能与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖含量不同有关，因而两类细菌对叶黄酮提取液的渗透作用响应不同，敏感性也有差异，这与王薇等[7]沙棘果渣黄酮对大肠杆菌、白色葡萄球菌的抑菌研究结论一致。
PCD或细胞凋亡是植物在生长发育过程中或在环境胁迫下可受机体调控的一种清除特定细胞的死亡方式[15-16，19]。当外界刺激程度超出植物自身的防御范围时，植物就会以ROS、NO等作为信号分子，诱导特定部位发生PCD，从而避免胁迫对其他组织的伤害，由此获得对不良环境的适应[19]。本研究发现短柄五加叶黄酮提取液能够引起洋葱鳞片叶表皮细胞出现液泡膜破裂，细胞质崩解、断裂，形成许多胞质小泡，细胞核变形，染色质凝集、趋边化等凋亡形态。Minina等[14]研究发现40~55℃热激引发植物发生的AL-PCD（apoptosis-like programmed cell death）过程中并不伴随细胞质膜起泡或形成凋亡小体，而是瞬间引起质膜通透性不可逆的增加和ATP耗尽，这与本试验中细胞凋亡的形态变化稍有差异，分析可能与植物遭受的外界胁迫条件不同有关。另外，有人将烟草BY-2细胞悬浮培养数周后用苔盼蓝和DAPI染色发现，在植物发育过程中发生凋亡细胞质皱缩、核染色质凝集、细胞核破裂等[14]，这与本试验结果中凋亡细胞形态有些相似，但却与重度温度胁迫触发的ePCD（environmental PCD）形态变化稍有不同[13-14]。马文杰等[13]也报道称在植物发育期间或遭受轻度非生物胁迫后发生的自溶性PCD类型，主要是依据PCD过程中液泡是否破裂以及其后细胞质物质是否快速消失等进行分类的。因此，本试验中，叶黄酮提取液诱导洋葱鳞片叶表皮细胞凋亡类型可能类似dPCD（development PCD）型[13]，暗示该处理属于一种比较轻度的逆境胁迫。
化感作用是在自然界中普遍存在的一种植物间相互作用。深入了解其自身毒性或植物毒性作用机制对于研究如何减轻作物连作障碍，以及在农业生产上如何利用好化感作用减少农药投入至关重要[22]。有学者提出植物长时间暴露于化感物质中可能会引起体内ROS过度爆发，而氧化损伤可能是化感物质毒性抑制目标植物生长的关键[24-25]。MDA是ROS引起的膜脂过氧化产物，其含量的高低可以直接反映膜脂过氧化程度，也决定了植物受到损伤程度。因此，MDA含量常常作为判断化感胁迫引起氧化损伤程度的指标[26]。Zhang等[23]研究发现异甘草素能够诱导莴苣幼苗中ROS过量产生和MDA水平升高，认为异甘草素抑制莴苣幼根伸长的化感机制很可能是由于ROS过量积累而导致膜脂氧化损伤和细胞死亡。Yan等[27]也发现甘草素处理导致莴苣幼苗根尖细胞分裂部分受阻滞，细胞活力和根系活力明显丧失，同时莴苣中ROS、MDA等过量产生。暗示甘草素的植物毒性很可能依赖于诱导ROS过量产生，导致膜脂过氧化，随后引起细胞死亡和有丝分裂过程紊乱。本试验结果显示，随短柄五加叶黄酮提取液处理浓度增大，洋葱鳞片叶表皮细胞凋亡率、MDA、H2O2含量逐渐升高，POD和CAT活性先升后降，且均显著高于对照，而SOD活性变化不显著，这与Zhang等[23]和Yan等[27]的研究结果有相似之处。另外，Chen等[28]在研究α-蒎烯对披碱草的化感作用时发现，随α-蒎烯处理浓度增加，披碱草幼苗中SOD活性先升后降，POD活性持续升高，而CAT活性虽然也先升后降，但却显著低于对照组。这与本试验中叶黄酮处理下洋葱鳞片叶中抗氧化酶活性变化有所不同，可能与处理的化感物质或物种不同有关。He等[24]在研究混合酚酸处理对半夏的化感机制时发现，酚酸处理能够诱导半夏根细胞中H2O2、O2·-过量积累，3种抗氧化酶活性随混合酚酸处理时间的延长，表现为SOD、CAT的活性先降后升，而POD的活性先升后降，这也与本试验结果有部分相似之处。在本试验中，随短柄五加叶黄酮提取液处理浓度增大，洋葱鳞片叶中POD和CAT活性表现出低促高抑效应，这可能是细胞内H2O2含量增多而启动的一种应激机制，以诱导体内抗氧化能力增强。但当提取液增大到一定浓度时，保护酶活性最终下降，导致洋葱体内过量的H2O2无法及时被清除，加剧洋葱的膜脂过氧化程度，使得MDA含量逐渐升高，最终引起细胞凋亡。
许多研究表明化感物质核桃酮、白桦素[25]及土荆芥挥发性化感物质[26]都能诱导细胞凋亡，引起受体植物防御功能障碍，从而抑制植物根系的生长[24]。本试验也发现短柄五加叶黄酮提取液处理能够显著抑制洋葱根、芽生长，且抑制率也存在浓度依赖关系。Yan等[29]发现青蒿素对莴苣幼苗的植物毒性机制是通过诱导细胞中过量生产ROS，并引起脂质过氧化损伤和细胞死亡，最终导致莴苣根和芽生长抑制，这与本试验结果相似。而王婧怡等[22]研究发现黄花草木樨香豆素水浸提液能够显著抑制苏丹草根的伸长，而对茎长的影响存在低促、高抑现象，这与本试验结果略有差异，可能与药液处理浓度或有效成分不同有关。本试验中，叶黄酮提取液能够抑制洋葱根和芽伸长，可能是由于叶黄酮化感物质胁迫引起洋葱体内ROS过量生产和MDA水平升高以及POD、CAT活性降低（高浓度），从而导致膜脂过氧化损伤、细胞活性降低，ROS清除平衡被打破，最终引起洋葱防御功能障碍，进而抑制其根、芽生长，其中具体的机制还有待进一步研究。
4 结论
短柄五加叶片提取叶黄酮得率为42.3 mg/g。叶黄酮提取液对革兰氏阳性菌（金黄葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）的抑菌效果均优于革兰氏阴性菌（沙门氏菌），且抑菌效果与浓度呈正相关，同时3种供试细菌的MIC值也与抑菌圈直径的表现一致。叶黄酮化感胁迫可引起洋葱叶表皮细胞出现dPCD型的凋亡形态，且细胞凋亡率、MDA、H2O2含量随处理液浓度增大而升高，POD、CAT活性先升后降，且具有一定的浓度依赖性。另外，不同浓度叶黄酮提取液化感胁迫导致洋葱根、芽生长抑制，其抑制率也具有浓度依赖关系。叶黄酮化感作用的潜在的分子机制可能是通过诱导洋葱鳞片叶中H2O2等ROS过量产生和MDA水平升高，以及抗氧化酶活性受抑制（高浓度），进而引起细胞氧化损伤和膜脂过氧化，最终触发细胞凋亡甚至死亡，并抑制根、芽的生长。因此，短柄五加叶黄酮提取液具有较强的抑菌活性以及化感物质细胞毒性，能够诱导洋葱鳞片叶表皮细胞凋亡和抑制根、芽生长。
图1不同浓度短柄五加叶黄酮提取液对3种菌株的抑菌效应比较
Fig.1Comparison of antibacterial effects of different concentrations of leaf flavonoids extracts from E. brachypus on three kinds of bacteria
图2不同浓度短柄五加叶黄酮提取液对洋葱鳞片内表皮细胞的凋亡诱导作用
Fig.2Apoptosis-inducing effects of different concentrations of leaf flavonoid extracts from E. brachypus on epidermal cells of A. cepa
图3不同时间不同浓度叶黄酮提取液处理下洋葱鳞片叶表皮细胞中MDA含量
Fig.3The MDA content in epidermal cells of A. cepa at different time and under the treatment of different concentrations of leaf flavonoid extracts from E. brachypus
图4不同浓度叶黄酮提取液处理下洋葱鳞片叶表皮细胞内ROS的分布原位观察（40×）
Fig.4In situ distribution of ROS in epidermal cells of onion scale leaves under the treatment of different concentrations of leaf flavonoid extracts (40×)
图5短柄五加叶黄酮提取液对洋葱根、芽生长的影响
Fig.5Allelopathic effects of leaf flavonoid extracts from E. brachypus on root and shoot growth of A. cepa
表1短柄五加叶黄酮提取液对3种供试菌的最低抑菌浓度
Table1The minimum inhibitory concentration (MIC) of leaf flavonoid extracts from E. brachypus against three kinds of bacteria
表2不同浓度叶黄酮提取液处理下洋葱鳞片叶表皮细胞中H2O2含量及抗氧化酶活性
Table2H2O2 content and antioxidant enzyme activity in epidermal cells of A. cepa under different concentrations of leaf flavonoid extract treatments from E. brachypus
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