摘要
【目的】探究盐肤木开花特性和花香成分及其释放规律,为进一步开发利用盐肤木花香提供依据。【方法】 用扫描电镜观察花粉形态,用顶空-固相微萃取(HS-SPME)与气相色谱联用(GC-MS)技术检测分析不同花期主要花香成分和日变化规律。【结果】盐肤木雌雄异株,圆锥花序,单枝花序集中开花,整株持续开花,花粉黄色,长球形具3孔沟,外壁具条纹。不同花期检测出花香物质共92种(萜烯类29种,醛类19种,酯类15种,醇类14种,酮类5 种,烯烃类4种,芳香烃类2种,酚类、烷烃类、酸类和其他类各1种)。其相对含量先升高后降低,在盛花期时达到最大(3.60μg/g),各花期间差异显著,种类持续增加。其盛花期共检测到84种花香物质,释放量日变化呈抛物线趋势,白天显著高于夜晚,18:00时达到最大(4.80μg/g),后持续降低,6:00时最低,仅2.58μg/g。其中萜烯类为盐肤木主要花香物质,相对含量约占总花香含量的70%。【结论】盐肤木花香成分丰富,具明显昼夜节律变化,萜烯类为其主要花香物质。
Abstract
[Objective] This study aims to clarify the basis of flower fragrance by explore the flowering characteristics and flower fragrance components and their release patterns of Rhus chinensis, so as to provide a basis for further development and utilization of floral fragrance of R. chinensis. [Methods] Scanning electron microscope was used to observe pollen morphology. Headspace-solid phase microextraction (HS-SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) techniques were used to analyze the main floral scent components in different flowering stages and daily change pattern. [Results] A total of 92 floral substances (29 terpenes, 19 aldehydes, 15 esters, 14 alcohols, 5 ketones, 4 olefins, 2 aromatic hydrocarbons, and 1 each of phenols, alkanes, acids, and others) were detected in different flowering periods. Its relative content was increased and then decreased, reaching a maximum (3.60 μg/g) at the full-flowering stage, with significant differences among the flowering stages. A total of 84 floral aroma substances were detected during full flowering stage. The release showed a parabolic daily variation trend, which was higher during the day than at night and reached the maximum at 18:00 (4.80 μg/g), and then continued to decrease and reached the lowest at 6:00, with 2.58 μg/g. Terpenes were the main floral substances of R. chinensis, with a relative content of about 70% of the total floral components. [Conclusion] R. chinensis is rich in floral components, with a clear diurnal rhythm. Terpenes are its main floral substances.
Keywords
植物花香和形态是衡量其观赏性的重要标准之一。花香是由花朵内部的挥发性低分子混合物形成的，常用于昆虫授粉、信息传递、香水、化妆品和药品等方面。花香也被广泛应用于园艺疗法和森林康养等领域[1-2]。盐肤木（Rhus chinensis Mill.）为漆树科（Anacadiaceae）盐肤木属（Rhus）秋色叶树种，分布广泛，在园林应用中可作为优良的观花、观叶、观果树种[3]，同时也是中国主要经济树种之一，常用于生产中药材五倍子[4]。目前有关盐肤木的研究报道主要集中在药用价值[5]、重金属胁迫[6]、五倍子培育[7]、种子育苗[8]及栽培[9]等方面。盐肤木雌、雄花均具有较强吸引蜜蜂的能力[10]，是秋季的主要蜜源植物之一[11]。盐肤木蜂蜜呈绿色，成分丰富，营养价值高，还有一定的单宁酸，相关指标达到中国一级蜂蜜品质要求，同时也是优质的地方特色蜂蜜产品[12-13]。多数漆树科植物具有特殊气味，其花朵中的挥发性物质常常被忽略，国内外对盐肤木开花特性、花粉形态及花香物质的研究鲜见报道。本研究拟通过观察盐肤木花和花粉形态变化，利用顶空-固相微萃取（HS-SPEM）与气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术，对盐肤木不同花期花香物质释放量及其主要花香成分日变化规律进行检测分析，为盐肤木的花香代谢、遗传和有效开发利用提供参考。
1 材料和方法
1.1 试验材料及取样处理
试验材料盐肤木采集于中国林科院高原林业研究所温室旁露地（102.76°E，25.07°N、海拔 1982 m）。于2023年8-10月观察花形态特征，在持续晴朗、光照良好天气选取树龄一致无病虫害的3个植株，收集上部、中部、下部东南西北各方位自然开放的不同时期花朵及成熟花粉用于试验。通过观察花朵形态特征，确认开花进程，划分并选择差异明显且具代表性的3个花期:花苞期（花蕾Ⅰ期、花蕾Ⅱ 期、初花期）、盛花期（盛花Ⅰ期、盛花Ⅱ期）和末花期（凋零期）; 盛花期日变化规律设定为一天之中的 00:00、6:00、12:00和18:00计4个时间段。采集后放入冰盒，带回实验室进行花香成分分析。每个处理重复3次。
1.2 试验方法
1.2.1 开花特性和花粉观察
选取3株盐肤木记录开花情况，并采集不同发育时期的新鲜花朵，在超景深三维显微镜（VHX-1000，KEYENCE，日本）下观察花及花药形态颜色。采集成熟花药平铺于硫酸纸上，于室内阴干后保存备用。用离子溅射仪（型号JS-1600，北京和同创业科技，中国）进行喷金，在花粉表面镀上1层金膜。使用扫描电镜（Tabletop Microscope 3000，日立，日本）观察，选取代表性视野观察并拍照记录花粉群体形态特征（放大3000倍）、花粉个体形态（放大3000 倍）、花粉赤道面中部的外壁纹饰（放大15000倍）。
1.2.2 花香测定
HS-SPME（Agilent，美国）取样:分别称取1.0 g样品，置于20 mL 顶空瓶中，加入10μL 浓度为 100μg/mL的萘内标，迅速盖上瓶盖; 用注射器针头戳破顶空盖硅胶封口，SPME 萃取头从戳破的顶空硅胶封口中插入顶空瓶; 释放 SPME 萃取头，将带有SPME的顶空瓶放于80℃恒温水浴萃取50 min，收起SPME萃取头; 将其插入气相色谱质谱联用仪（7890B-5977B，Agilent，美国）进样口，进样 2 min按照下述条件对 SPME 萃取的样品进行上机分析。每个处理3次生物学重复。
GC-MS分析:载气为氦气，纯度为 99.999%，流速为1mL/min; 进样口温度为250℃; 进样口分流比为10∶1; MSD传输线温度为280℃; MS四级杆温度为150℃; 离子源温度为230℃; 扫描范围为 35~450amu; 离子源为EI，电子轰击能量为70eV。升温程序:50℃为起始温度（保持1min），以3℃/ min升到180℃，再以15℃/min升到250℃（保持 3min）。
1.3 数据整理与分析
用 CAD2022软件测量花粉的赤道轴（E）和极轴（P）大小。花粉形状用P/E 表示、花粉大小以P ×E 表示。利用质谱数据库及各个峰的相对保留时间对各峰的质谱图进行 GC-MS分析，从而确定各个峰所对应盐肤木花香中的各种挥发性物质。用峰面积归一法计算样品中化合物的相对含量。用 SPSS 26软件对数据进行单因素的方差分析，计算标准误差，并用 Origin 2018软件绘图。
2 结果与分析
2.1 盐肤木开花特性
盐肤木圆锥花序生于枝顶，分枝多，雄花序长 30~40cm，小花较疏（图1，A），雌花序较短，长20~35cm，小花较紧密（图1，B）; 单花乳白色，直径约 4mm，花瓣5枚，内中下部及边缘具白色细睫毛，萼片5枚; 圆锥花序由下往上陆续开放，同树花序由低往高依次开放。随光照不同，花朵开放程度不一，同一时期光照充足面花朵开放程度高，光照弱开花缓慢多花苞（图1，C）。
盐肤木花萼外被微柔毛，长约0.6mm，边缘具细睫毛; 花瓣长圆形，长约2mm。雄花:雄蕊5枚，开花时外卷（图1，D）; 花丝线形，长约2.5mm，无毛，花药卵形，长约0.7mm（图1，E），花粉黄色（图1，F），子房不育。雌花:雄蕊退化，花丝短，花药褐色干瘪，子房卵形，长约1mm，花柱3，柱头头状（图1，G）。
如图2所示，将盐肤木开花期分为 6 个时期。（1）花蕾Ⅰ期，花蕾未展开，整体呈圆形，萼片和花瓣紧闭，呈淡绿色球状小花苞。（2）花蕾Ⅱ期，花蕾变大，椭圆形，萼片和花瓣微微分离，花瓣由淡绿色变为白色。（3）初花期，花蕾初步开放，萼片和花瓣分离，花直径大于1.5cm，雄花花药、雌花柱头露出，均为黄色。（4）盛花Ⅰ期，花蕾完全开放，雄花花瓣向外延展外卷; 雄蕊伸出，花直径大于2.5cm，花开放但花药未开裂，雌花花瓣舒展，未受精。（5）盛花 Ⅱ期，雄花花药开裂，花粉黄色，花逐步失水，由乳白色变为淡黄白色，花器官逐渐卷缩; 雌花受精完成，柱头变黑，子房膨大变红，花瓣卷曲逐步失水。（6）凋谢期，花瓣完全失水，呈褐色，雄花自然掉落，雌花逐步发育为红色核果。
如图3所示，盐肤木花粉粒具 3 孔沟，辐射对称，极面观3裂圆形，赤道面观椭圆形。盐肤木花粉 P 为33.805~43.751μm，E 为 18.753~21.875 μm。P/E 平均值为1.83，按王伏雄等[14]的分级标准，花粉形状为长球形（1.14<P/E<2）; 花粉大小约为38μm×20μm，盐肤木花粉属于中等的级别（直径25~50μm），萌发沟窄长。外壁表面具条纹纹饰，条脊分叉，分布较紧密，脊间无穿孔。
图1盐肤木花序、花蕾及花药形态特征
Fig.1Morphological characteristics of inflorescences, buds, and anthers of R. chinensis
A.雄花花序；B.雌花花序；C.光照不均匀下开放的雄花花序；D.雄花；E.未开裂花药；F.开裂花药；G.雌花。
A. Male inflorescence. B. Female inflorescence. C. Open male inflorescence under uneven illumination. D. Male flower. E. Uncracked anthers. F. Cracking anthers. G. Female flower.
图2不同发育阶段的盐肤木花
Fig.2Flowers of R. chinensis at different developmental stages
A.雄花；B.雌花；1.花蕾Ⅰ期；2.花蕾Ⅱ期；3.初花期；4.盛花Ⅰ期；5.盛花Ⅱ期；6.凋谢期。
A, male flowers. B, female flowers.1, budding stage Ⅰ.2, budding stage Ⅱ.3, primordial stage.4, full-flowering stage Ⅰ.5, full-flowering stage Ⅱ.6, withering stage.
图3盐肤木花粉电镜扫描结构
Fig.3Electron microscope scanning of pollen structure of R. chinensis
A.整体观；B.赤道面观；C.极面观；D.纹饰。
A. Holistic view. B. Equatorial view. C. Polar view. D. Ornamentation.
2.2 盐肤木不同花期花香成分变化
盐肤木3个花期花香成分测定分析结果（图4、表1）表明，共检测出92种挥发性物质，分为萜烯类、醛类、酯类、醇类、酮类、酚类、烯烃类、烷烃类、芳香烃类、酸类及其他化合物。随花朵开放进程，花香成分种类逐渐增加，在花苞期（花蕾Ⅰ、花蕾Ⅱ、初花期），盛花期（盛花Ⅰ期、盛花Ⅱ期）和末花期（凋谢期）分别检测到69，81，85种花香物质。不同花期花香成分释放量存在显著差异，随开花进程，花香成分的相对含量呈抛物线变化趋势。花苞期较低，后逐渐上升，到盛花期时达到最高（3.60μg/g），后随着花朵衰败，含量减少，末花期花香相对含量最低，仅为2.40μg/g（图5）。
图4盐肤木不同花期花香成分总离子流图
Fig.4Total ion flow diagram of floral components of R. chinensis at different flowering stages
盐肤木花期中花香物质主要以萜烯类物质为主，释放量最高。随着花的发育，萜烯类物质种类增加，相对含量呈先上升后下降的趋势，其在总花香成分含量占比显著降低（表1）。花苞期检测到萜烯类物质 23种，占其总香气成分的81.46%，其中α-芹子烯释放量最高（28.18%），β-芹子烯次之（22.26%）。盛花期萜烯类增加到28种，其占比72.90%，其中E，E-α金合欢烯相对含量最高，α-芹子烯和β-芹子烯次之，较于花苞期其相对含量降低。末花期萜烯类相对含量及占比迅速下降，占其总花香成分含量的48.67%。
醛类物质作为盐肤木花香物质的第二大类，随着开花进程种类及释放量持续上升，末花期达到最大（18种，0.57μg/g），其中壬醛相对含量最高。醛类物质在末花期释放量更为显著，2，4-壬二烯醛和十五醛仅存在于末花期。酯类、醇类、酚类和其他类释放量与醛类趋势相同，呈上升趋势。酚类在末花期检出，花苞期未检出，而盛花期含量极低。酮类、烯烃类和烷烃类的相对含量与萜烯类一致，随着花的发育进程先上升后下降。芳香烃类及酸类占盐肤木花香成分的较少部分，从花苞期到盛花期再到末花期，呈先下降后上升的趋势。
图5盐肤木不同花期花香成分变化
Fig.5Changes in aromatic composition in different flowering periods of R. chinensis
表1不同花期的盐肤木花香成分及分类占比统计
Table1Classification statistics of aromatic composion and proportion in different flowering stages of R. chinensis
注:括号内的数字表示化合物数量，“-”表示未检测到或不存在。同行不同小写字母表示同一化合物不同花期在0.05水平上存在显著差异。下同。
Note: The numbers in parentheses indicate the number of compounds, “-” indicates undetected or non-existent. The different lowercase letters within same row indicate significant differences at the 0.05 level among different flowering stages of the same compound. The same as below.
2.3 盐肤木盛花期花香成分日变化规律分析
盐肤木盛花期花香物质总释放量存在显著差异，日变化呈抛物线趋势（表2），6:00时最低（2.57 μg/g），随后相对含量逐渐上升，12:00 时增加至 3.60μg/g，18:00时增加到4.80μg/g，达到最大，后迅速下降，24:00为3.41μg/g，后其释放量持续降低。
盐肤木盛花期共检测出花香物质84种，其中萜烯类27种，醛类17种，酯类14种，醇类13种，酮类 4种，烯烃类3种，芳香烃类3种，烷烃类、酸类和其他各1种。盛花期中香气成分日变化以萜烯类、醛类、酯类和烯烃类化合物为主。
表2盐肤木盛花期花香成分相对含量日变化
Table2Relative content of daily variation of aromatic composion during the full flowering stage of R. chinensis
续表2 Continued table 2
萜烯类在盐肤木盛花期日变化规律中占主要地位（占总花香含量73.74%），与总含量变化趋势一致，先上升后下降，在18:00时达到最大（占其时段花香含量80.25%），6:00时花香释放量最低（占其时段花香含量69.31%），见图6。萜烯类化合物中主要花香成分为 E，E-α-金合欢烯，α-芹子烯次之，再次为β-芹子烯。E，E-α-金合欢烯在日变化中释放量呈上升—下降—上升—再下降趋势，于 12:00 其总释放量达到最大（0.96μg/g）。α-芹子烯和β芹子烯呈抛物线趋势，18:00时释放量最大，分别为 0.89μg/g和0.68μg/g。
图6盐肤木盛花期花香成分百分比日变化
Fig.6Diurnal variation of percentage of floral aroma components in R. chinensis
醛类为盐肤木盛花期日变化中第二大类物质（占总花香含量 9.63%），整体释放量呈上升—下降—上升—再下降的变化趋势。12:00时释放量最高（占其时段花香含量10.94%），6:00时最低（占其时段花香含量10.59%）。壬醛为醛类物质中主要花香成分，6:00时其释放量最低，随着时间变化，相对含量显著升高到12:00达到最大0.20μg/g，后下降。酯类（14）和烯烃类（3）作为第三大类化合物，分别占总花香含量6.05%和5.83%。酯类日变化持续升高趋势，18:00—24:00 增长明显，在 24:00 释放量最高（占其时段花香含量9.05%）。其中月桂酸乙酯释放量最高，十四酸乙酯次之。烯烃类日变化规律呈抛物线趋势，18:00达到最大（占其花香含量5.27%）后，其相对含量显著降低。烯烃类仅检测到3种化合物，但其相对含量略高于酯类。其余化合物中，醇类和酸类日变化均呈先降低后升高的趋势; 烷烃类则与其相反:先升高后降低; 酮类和其他类均为升高—降低—升高，芳香烃类与其相反: 日变化呈抛物线趋势。
3 讨论
3.1 开花特性及花粉形态
植物开花物候常在集中或连续开花模式之间变化[15]。盐肤木花期8-10月，圆锥花序，是秋季重要的蜜源植物。整株由低往高呈持续开花模式，单枝花序呈集中开花模式。盐肤木花小紧密，花粉量大，盛花期即将结束时，其花序顶端仍有少数花苞期结构，在末花期陆续开放，极大程度上吸引传粉者。在漫长的演变过程中，植物在花性分化上形成了差异。盐肤木雄花序较雌花序宽大疏松，雌花中雄蕊退化，花药干瘪，花丝极短，而雄花中子房不育，是其长期进化特征，巧妙地保证它们在繁殖上的优势。花粉是植物特有的器官，其形态特征受基因控制，受外界环境条件影响较小，具有较强的遗传稳定性、可靠性和保守性，可为其系统分类和物种起源提供依据[16-17]。本研究中盐肤木花粉黄色，具3孔沟，长球形，辐射对称，极面观3裂圆形，赤道面观椭圆形，外壁表面具条纹，可能是其长期进化的特征。
3.2 花香成分
植物花香的差异取决于花香挥发物的组成和含量[18]，随开花进程，不同发育阶段花朵释放的花香物质存在显著差异[19]。本研究共鉴定出92种花香物质，从花苞期至末花期相对含量变化呈抛物线趋势，释放量在盛花期达到最大，这与紫花含笑（Michelia crassipes）[20]和大彗星风兰（Angraecum sesquipedale）[21]等的研究结果一致。盐肤木不同花期花香物质分为萜烯类（29）、醛类（19）、酯类（15）、醇类（14）、酮类（5）、酚类（1）、烯烃类（4）、烷烃类（1）、芳香烃类（2）、酸类（1）及其他化合物（1）。从花苞期到末花期，萜烯类、酮类、烯烃类和烷烃类含量均呈抛物线形变化趋势，在盛花期时期相对含量最高。醛类、酯类、醇类、酚类、芳香烃类和其他类含量随着开花进程持续升高。酸类物质含量呈先下降后上升趋势。盐肤木花香成分及相对含量随开花进程不断变化，与流苏树（Chionanthus retusus）[22]的变化规律一致。
盐肤木花香物质中萜烯类种类丰富，占成分 70%以上，是盐肤木主要花香物质，同时也是天然抗氧化剂和抗菌剂的来源[23]，有良好的杀菌抑菌、康体保健和净化空气等作用[24]。大量存在于某个时期的萜烯类物质具有很高的提取利用价值，如 E，E-α-金合欢烯大量存在于盐肤木盛花期阶段，不仅对许多植物的抗虫性[25]具有重要影响外，发现玫红百合（Lilium amoenum）[26]的玫瑰气味与α-金合欢烯有关，明确 E，E-α-金合欢烯是玫瑰[27]主要香气成分之一。α-芹子烯、β-芹子烯、δ-杜松烯、β-石竹烯和α-律草烯等多存在于盐肤木花苞期。而以α-蒎烯、α-芹子烯和β-芹子烯等为主要成分的针叶精油[28]具有显著的抗氧化、抗菌和抗癌活性。杜松烯对 H9c2细胞缺氧损伤[29]有一定的保护作用，δ-杜松烯对兔痒螨[30]具有显著的杀螨活性，榄香烯有极高抗肿瘤活性[31]。除萜烯类化合物外，醛类为盐肤木第二大类花香物质，其中壬醛释放量高，随着花朵开放，其相对含量持续增加，具有甜橙及玫瑰香气，可用于玫瑰（Rosa rugosa）等香精的调制[32]。
植物花香释放有明显的昼夜节律变化，这与环境条件息息相关，温度尤为明显[33]。本研究结果显示盐肤木花香成分释放量随时间的日变化呈抛物线趋势，白天释放量高于夜间，变化规律与鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum）[34]一致。盐肤木花香成分在 12:00 时花香化合物类型最多，释放量从 12:00到18:00持续上升，18:00时相对含量达到峰值。这可能与气温高、光照强更易释放有关，这一研究结果与海棠（Malus ioensis）[35]相关日变化规律一致。
4 结论
盐肤木圆锥花序大，多分枝，花小紧密，花粉量大，整株由低往高呈持续开花模式，单枝花序呈集中开花模式。其花香含有丰富的萜烯类物质，释放量随开花进程呈抛物线趋势，在盛花期达到最大; 花香物质释放量受环境因素等影响，有明显的昼夜节律变化规律，白天释放量高于夜晚。
