摘要
【目的】滇牡丹作为牡丹育种材料,具有丰富的花色资源,研究其 MYB转录因子对花色的调控作用可为牡丹花色分子育种工作提供帮助。【方法】以黄色及红色滇牡丹花部组织为材料进行徒手切片,并以其转录组数据为基础进行序列比对,得到1个 MYB转录因子编码基因 PdMYB57。经基因克隆、系统进化树构建、定量逆转录聚合酶链式反应(qPCR)、瞬时表达及高效液相色谱(HPLC)等验证该基因功能。【结果】PdMYB57 基因有1个798 bp的完整开放阅读框,编码265个氨基酸,为亲水性不稳定蛋白;与拟南芥 SG6亚族及卵叶牡丹 PqMYB113、牡丹 PsMYB57/PsMYB58及葡萄 VvMYBA1/VvMYBA2等 MYB转录因子聚为一簇,具有 R2R3保守结构域[R/K]Px[P/A/R]xx[F/Y]基序;其在红色花滇牡丹萼片及黄色花滇牡丹叶片中高表达;其瞬时表达后能使烟草叶片产生紫色,HPLC表明其瞬时表达的烟草叶片中含有矢车菊素3-O-芸香糖苷(Cy3R)。【结论】PdMYB57 基因编码1个 R2R3-MYB转录因子,其表达具有组织特异性,并能促进植物花青素合成。
Abstract
[Objective] As a peony breeding material, Paeonia delavayi has abundant flower color resources. Studying the regulatory effects of its MYB transcription factors on flower color will benefit molecular breeding of peony flower color. [Methods] Using the flowers of yellow and red P. delavayi as materials for hand sectioning. Based on the transcriptomic data of P. delavayi, a MYB transcription factor coding gene PdMYB57 was obtained through sequence alignment. Function of this gene was verified through gene cloning, phylogenetic tree construction, qRT-PCR, transient expression, and HPLC. [Results] PdMYB57 gene has an ORF of 798 bp, encoding an unstable hydrophilic protein of 265 amino acids. PdMYB57 was clustered with the Arabidopsis SG6 subfamily, as well as MYB transcription factors in P. qiui PqMYB113, P. suffruticosa PsMYB57/PsMYB58, and Vitis vinifera VvMYBA1/VvMYBA2. PdMYB57 had a R2R3 conserved domain [R/K] Px [P/A/R] xx [F/Y] motif. PdMYB57 gene was highly expressed in sepals of red P. delavayi and leaves of yellow P. delavayi. HPLC analysis showed that tobacco leaves transiently expressed PdMYB57 gene contained cyanidin-3-O-rutinoside (Cy3R). [Conclusion] PdMYB57 gene encodes an R2R3-MYB transcription factor. PdMYB57 gene expression is tissue-specific and promotes anthocyanin synthesis in plants.
Keywords
滇牡丹（Paeonia delavayi）为国家Ⅱ级重点野生保护植物[1]，属于芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）牡丹组（Paeonia sect.Moutan DC.）多年生亚灌木。它自然生长于海拔1900~4000 m 的中国西南山地[2]，具有重要的观赏[3-4]、药用[5-6]和油用[7]价值。滇牡丹的花色极为丰富[8-9]，除牡丹组植物中稀有的黄色系外，滇牡丹还有白色、粉色、红色、深红色、深紫红色、橙色、黄绿色和绿色等多种花色[10]，既是牡丹组植物中花色最为丰富、适应范围最广的物种，也是牡丹新品种培育中不可或缺的育种基因材料。通过黄色花滇牡丹基因资源已培育出金阁（Paeonia ×suffruticosa Andrews‘Jinge’）、海黄（Paeonia ×suffruticosa Andrews‘Haihuang’）、金晃（Paeonia ×suffruticosa Andrews‘Jinhuang’）等珍贵的黄色系观赏牡丹品种[11-12]。因此，研究滇牡丹花色调控相关基因的作用和机能可为牡丹新品种培育提供重要的数据支持。
MYB（myeloblastosis）转录因子被认为是决定花青素模式最特异及最显著的调控因子[13-14]，MYB 可分为4个亚类，R1/R2-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB以及4R-MYB，其中，参与调控花青素生物合成相关的 MYB 转录因子主要为 R2R3-MYB 类蛋白[15]。有关 R2R3-MYB类蛋白调控花青素合成与积累的研究均有深入的报道，但不同植物中 MYB 数量众多且调控机理和组织表达存在差异。邹红竹等以纯黄色滇牡丹为研究材料，通过其转录组数据对滇牡丹中 MYB 家族进行分析，共得到 64 个 MYB家族成员，其中，R2R3-MYB成员就有25个，并对其中 PdMYB2转录因子的功能进行验证，表明过表达PdMYB2 能够增加花青素在烟草茎、叶及花中的积累，qPCR结果表明 PdMYB2 在过表达烟草茎中的表达最高[16]。从牡丹组植物（P.suffruticosa）中也克隆得到多个与花青素合成相关的 R2R3-MYB转录因子，并对其功能进行验证。从牡丹花瓣中克隆得到 PsMYB114L和 PsMYB12L，研究表明二者为正向调控植物体内花青素合成的 R2R3-MYB转录因子，在拟南芥中异源表达 PsMYB114L 和PsMYB12L 能使拟南芥叶片中花青素的含量显著增加，从而产生紫红色的叶子[17]。
研究表明 PsMYB58 能与 PsbHLH1 和 PsbHLH3共同作用，对植物花青素的合成进行调控，过表达PsMYB58 能使烟草叶片、花瓣、花丝及果荚等器官中花青素的含量显著增加[18]。转录因子 PsMYB1能与 PsWD40互作，调控花青苷合成酶基因PsCHS 和PsF3H 表达，从而调控花色的形成，在烟草中过表达 PsMYB1 能够使烟草花瓣、叶片、萼片、雄蕊、果皮及种皮等多个器官着色，并与光照存在显著的正相关性，光照越强，着色越深[19]。R2R3-MYB转录因子PsMYB12能与bHLH 和 WD40蛋白互作，激活调控牡丹花瓣斑点中 PsCHS 的表达，其时空表达模式与花瓣斑点的发育密切相关[20]。 R2R3-MYB转录因子基因 PsMYB57 主要在牡丹的芽和幼叶中进行转录，过表达 PsMYB57 能够诱导烟草叶片、花萼及果皮中花青素含量的增加，但花瓣颜色无明显变化[21]。
植物中 R2R3-MYB 数量众多，但有关滇牡丹 MYB转录因子的克隆及功能研究鲜有报道，筛选滇牡丹中参与调控花青苷合成的 MYB家族成员并对其功能进行研究，是滇牡丹花色调控的关键问题和重要研究方向。因此，本研究通过与课题组滇牡丹转录组数据进行本地 Blast序列比对，得到1个与滇牡丹花青素合成相关的 MYB 转录因子，命名为 PdMYB57，并分析其理化性质及功能，以深入阐明滇牡丹中花青素生物合成的分子调控机理，进而为研究其分子机制提供理论依据及支撑。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料
2021年4月中旬早上9:00—10:00在云南省昆明市梁王山滇牡丹种植基地内采集黄色与红色花滇牡丹盛开时期（花瓣展开，雌雄蕊可见）的花瓣、萼片、雄蕊、茎、叶等组织用于转录组测序，每种花色采集3株作为3个生物学重复，每株上采集3朵花混样后作为3次技术重复，液氮速冻后储存于-80℃ 冰箱内（图1）。样品采集完毕后送至百迈客生物科技有限公司进行样品的测序和文库构建，使用Illumina HiSeq TM4000进行测序。
图1黄色与红色花滇牡丹植株
Fig.1Yellow petal and red petal P. delavayi
A．黄色花滇牡丹；B．红色花滇牡丹；C．滇牡丹叶片。1、4.花；2、3、5、6.植株。
A. Yellow petal P. delavayi. B. Red petal P. delavayi. C. Leaves of P. delavayi.1, 4, flowers.2, 3, 5, 6, plants.
1.1.2 试剂与仪器
E.Z.N.A.® Plant RNA Kit植物 RNA 提取试剂盒、Plasmid DNA Kit质粒提取试剂盒、TransStart Taq DNA Polymerase反转录试剂盒、TransStart ® Taq DNA Polymerase PCR 酶、EasyPure ® Quick Gel Extraction Kit琼脂凝胶纯化回收试剂盒、 pEASY ®-T5 Zero Cloning Kit（CT501T）载体、感受态细胞 Trans1-T1、PerfectStart ® Green qPCR SuperMix实时荧光定量分析试剂盒。使用的主要仪器有 BX53F2奥林巴斯显微镜、Agilent 1260 液相色谱仪、Biometra TADVANCED 双槽梯度 PCR 仪、Himac-CR22N 高速冷冻离心机、旻泉 ZQZY-75CN 全温叠加摇床以及 ROCHE LightCycler ® 96实时荧光定量 PCR仪[22]。
1.2 试验方法
1.2.1 花瓣呈色的细胞结构观察
以2种花色滇牡丹的花瓣、萼片、花药及花丝为材料进行徒手切片。使用刀片将各组织表皮撕下，并对各组织进行横向切片，使用蒸馏水将二者制成临时玻片，放于奥林巴斯显微镜（BX53F2）下进行观察，并拍照。使用 Adobe Photoshop CC 2017以及 Adobe Illustrator 2022对图片进行整理。
1.2.2 总 RNA提取及cDNA合成
将样品液氮研磨至粉末状，按照 E.Z.N.A.® Plant RNA Kit植物 RNA 提取试剂盒说明书进行滇牡丹各组织部位 RNA 的提取，然后通过1%琼脂糖凝胶电泳和 De Novix spectrophotometers超微量紫外可见分光光度计检测总 RNA 的完整性、纯度及浓度。使用TransStart Taq DNA Polymerase 反转录试剂盒进行cDNA 的合成。
1.2.3 PdMYB57 基因全长克隆
以牡丹PsMYB57 核苷酸序列为模板序列[21]，通过linux 系统使用 Blast:blastn-dbisoseq_flnc. blastdb-queryMYB.txt-outfmt7>1.out命令将其与滇牡丹转录组数据进行本地 Blast比对，得到滇牡丹中与PsMYB57 序列结构相似的1条基因序列 Mix-74_transcript_64363 将其命名为 PdMYB57。基于实验室滇牡丹转录组测序 Unigene基因序列，结合 NCBI ORF finder工具及 DNAMAN 软件设计特异性引物（表1）。以红色花滇牡丹花瓣cDNA 为模板，进行 PdMYB57 基因的聚合酶链式反应（PCR）。反应体系为25μL，扩增程序:94℃预变性 4min（1个循环）; 94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s（35个循环）; 72℃延伸10min（1个循环）[22]。经1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
扩增产物经EasyPure ® Quick Gel Extraction Kit PCR 胶回收纯化试剂盒回收后，与 pEASY ®-T5 Zero Cloning Kit T 载体连接，热击法转化感受态细胞 Trans1-T1，经菌液 PCR 检验合格后，使用 Plasmid DNA Kit质粒提取试剂盒（OMEGA 公司）提取质粒，送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司进行测序。
表1PdMYB57 基因克隆及表达分析所用引物
Table1Primers for PdMYB57 gene cloning and expression analysis
1.2.4 PdMYB57 基因生物信息学分析
用 NCBI ORF finder（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/orffinder/）工具查询 MYB 基因全长序列的开放阅读框（open reading frame，ORF）区域，并预测氨基酸序列; 用 ExPASy ProtParam（https:// web.expasy.org/protparam/）在线软件推测蛋白质的基本理化性质，ProtScale（https://web.expasy. org/protscale/）软件预测蛋白亲水性; 用 TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）软件预测蛋白质跨膜区，SignalP4.1 Server（https:// services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）软件预测蛋白质信号肽; 用 NetPhos-3.1（https:// services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）在线软件预测蛋白质的磷酸化位点; 用 GOR（https:// npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa _ automat.pl? page=npsa_gor4.html）软件预测蛋白质的二级结构，Swiss-model（https://swissmodel.expasy.org/）软件预测蛋白质三级结构[23-25]。
为通过系统发育树分析对 PdMYB57 基因进行功能分类，从拟南芥信息资源网站（https:// www.arabidopsis.org/）获得拟南芥 MYB 基因家族所编码的氨基酸序列，并根据文献从 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载牡丹 PsMYB58（基因:QZJ84669.1）和PsMYB57（基因: QIG55740.1）[18，21]、卵叶牡丹（P.qiui）PqMYB113（基因:MK461327.1）[26]及葡萄（V.vinifera）VvMYBA1（基因:BAD18977.1）与 VvMYBA2（基因: BAD18978.1）[27]等显著促进花青素合成的 MYB 基因所编码的氨基酸序列，用 MEGA11 进行比对并构建 NJ（邻接法）树，后使用iTOL网站（https:// itol.embl.de/）对树进行美化。用 MEGA11对 PdMYB57氨基酸序列与系统发育树中聚为一簇的氨基酸序列进行比对，并用 ESPript3.0（https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php）网站对序列比对结果进行美化。
1.2.5 PdMYB57 组织表达模式分析
以Actin（肌动蛋白）作为内参基因，使用 DNA-MAN 软件设计引物（表1），以稀释5倍后的cDNA 为模板，根据 PerfectStart ® Green qPCR SuperMix试剂盒说明书进行qPCR 反应，反应体系为20 μL（模板1μL、前端引物0.4μL、后端引物0.4μL、 2×PerfectStart ® Green qPCR SuperMix 10μL、 Nuclea-free H2O 8.2μL），反应程序:94℃预变性 30s（1个循环），94℃变性5s，60℃延伸30s（40 个循环）。最终结果以 进行计算。所有 qPCR反应均进行3次生物学重复和技术重复。
1.2.6 滇牡丹不同颜色花瓣植株的组织器官花青素含量测定及与PdMYB57 基因表达的相关性分析
以花瓣、萼片、雄蕊、茎、叶为材料进行 HPLC 实验。新鲜样品经 FD-304箱式真空冷冻干燥机冻干后研磨成粉末，溶于70%甲醇（含1%甲酸）的提取液中进行抽提，离心获得上清用于实验[28]。分析前使用0.45μm 过滤器过滤上清液，HPLC-DAD 进行分析，每个样品重复3次。分析条件:色谱柱（ZORBAX SB-CB4.6mm×150mm，5μL）; 流动相（C:乙腈，D:0.1%甲酸）; 流速为0.8mL/min; 进样量为10μL; 柱温为（30±0.8）℃; 检测波长520 nm，检测波长范围190~800nm; 方法 0~5 min，5%~5% C（该步骤为前期平衡柱子的5min）; 5~55min，5%~27% C。以矢车菊素双葡萄糖苷（cyanidin-3，5-di-O-glucoside，Cy3G5G）、芍药素双葡萄糖苷（peonidin-3，5-di-O-glucoside，Pn3G5G）、矢车菊素3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，Cy3G）、芍药素3-O-葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucoside，Pn3G）及 Cy3R作为标准品进行峰鉴定。以不同浓度为 X（mg/mL），峰面积为Y 绘制标准曲线对样品中花青素进行定量分析[29]，最后得到标准曲线:Cy3G5G，Y=1540.7X-12.717（R 2=0.9991）; Pn3G5G，Y =1441.9X-24.96（R 2 =0.9999）; Cy3G，Y = 6823X-31.71（R 2=0.9993）; Pn3G，Y=5939.6X-62.074（R 2 =0.9994）; Cy3R，Y=6283X-51.80（R 2 =0.9990）。通过 Origin 2022 软件，将 PdMYB57 基因在滇牡丹各组织的qPCR表达量与花青素含量进行相关性分析，探讨PdMYB57 基因表达与花青素含量之间的关系。
1.2.7 PdMYB57 基因瞬时表达
根据课题组前期保存的质粒信息，使用 SnapGene ® 4.1.8软件构建 PdMYB57 质粒，送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。取50μL感受态细胞（GV3101农杆菌），加入40ng含目的基因片段的质粒载体，冻融转化感受态细胞。摇菌重悬后，注射于烟草叶背下表皮中。以课题组已有矮牵牛（Petunia hybrida）AN2 基因为阳性对照，空载体为阴性对照，1次处理重复10次; 暗培养12h后置于光照培养下观察，光照10d后拍照取样，然后通过 HPLC检测烟草叶片中的花青素[30]。
2 结果与分析
2.1 花青素组织分布观察
黄色花滇牡丹花瓣整体为黄色，基部带有明显的三角形红色斑块，长度约为花瓣长的1/3，花瓣有斑、无斑部分色素积累有明显差异。黄色花瓣基部有斑部位的横切图显示，在斑块上下表皮细胞和紧接表皮细胞的第1层叶肉细胞中均有色素分布，且近轴面的上表皮与远轴面的下表皮细胞中色素积累有明显差异; 上表皮细胞的液泡中有大量色素积累，呈深红色，紧接上表皮细胞的第1层叶肉细胞约有1/5的细胞中有色素积累，均为浅红色; 而远轴面仅有1/3的下表皮细胞的液泡中有色素的积累，颜色呈浅红至红色（图2，A，a-d）。红色花滇牡丹花瓣为深红色，基部斑块不明显，花青素分布在其上下表皮细胞中，同样花青素富集在红色花滇牡丹花瓣近轴面的上表皮细胞中，远轴面仅有3/5的下表皮细胞的液泡中有色素的积累（图2，B，j、k）。黄色花滇牡丹萼片为绿色，无花青素积累; 花药为黄色，无花青素积累; 花丝为红色，花青素均匀分布于花丝表皮细胞中（图2，A，e-i）。红色花滇牡丹萼片正面除顶部外具有大面积红斑，背面边缘及中部均具小面积红斑，花青素主要分布在其近轴面的上表皮细胞中呈现出红色，远轴面下表皮细胞中无花青素积累; 红色花滇牡丹花药为黄色，无花青素积累; 花丝为深红色，花青素均匀分布于花丝的表皮细胞中（图2，B，l-p）。
2.2 PdMYB57 基因克隆
扩增产物位于 750~1000bp，测序结果使用 NCBI在线软件进行分析，结果显示，该序列全长900 bp，与预测结果一致，并具有1个798bp的完整开放阅读框，编码265个氨基酸，命名为 PdMYB57 提交至 GenBank，GenBank号为 ON226993.1（图3）。
2.3 PdMYB57蛋白理化性质预测
用ExPASy ProtParam 在线软件预测 PdMYB57 蛋白质的基本理化性质，结果表明 PdMYB57蛋白质序列具有265个氨基酸，分子量为29856.16D，理论 pI（等电点）为9.28，带负电荷的残基总数（Asp+Glu）28，带正电荷的残基总数（Arg+Lys）37，亮氨酸（Leu）在其中占有最高的比例; 含有3982个原子，分子式为C1317H2094N382O387S12，半衰期30h，不稳定指数（Ⅱ）计算为55.05，这将蛋白质归类为不稳定蛋白质，脂肪指数为79.13，亲水性总平均值（GRAFY）为-0.536，为不稳定的亲水性蛋白; 用 ProtScale在线软件对蛋白的亲水/疏水性（正值表示疏水性，负值表示亲水性）进行验证，结果显示负值数量多于正值数量，表现出亲水性; 用SignalP4.1 Server在线软件预测蛋白质的信号肽，结果显示 PdMYB57蛋白质氨基酸残基平均信号肽没有超过其阈值0.5，因此，该蛋白不存在信号肽，不能引导蛋白质的跨膜运输; 随后使用 TMHMM 在线软件对蛋白跨膜区域进行预测，未发现跨膜结构，说明 PdMYB57蛋白为不具有信号识别功能的非分泌蛋白（图4）。
图2滇牡丹花部组织徒手切片
Fig.2Hand sectioning of the flower tissues of P. delavayi
A．黄色花滇牡丹；a.花瓣无斑部分横切；b.花瓣无斑部分近轴面表皮细胞；c.花瓣有斑部分横切； d.花瓣有斑部分近轴面表皮细胞；e.萼片横切；f.萼片近轴面表皮细胞；g.花药横切；h.花丝横切；i.花丝表皮细胞； B．红色花滇牡丹；j.花瓣横切；k.花瓣近轴面表皮细胞；l.萼片横切；m.萼片近轴面表皮细胞；n.花药横切； o.花丝横切；p.花丝表皮细胞；1.角质层；2.上表皮细胞；3.下表皮细胞；4.海绵组织；5.维管束；6.表皮；7.纤维层； 8.花粉囊；9.药隔内的维管束；10.药隔薄壁组织。
A．Yellow petal P. delavayi. a, transverse section of the petal without spots. b, epidermal cells of the adaxial surface of the petal without spots. c, transverse section of the petal with spots. d, epidermal cells of the adaxial surface of the petal with spots. e, transverse section of the calyx. f, epidermal cells of the adaxial surface of the calyx. g, transverse section of the anther. h, transverse section of the filament. i, epidermal cells of the filament. B．Red petal P. delavayi. j, transverse section of petal. k, epidermal cells of petal adaxial surface. l, transverse section of calyx. m, epidermal cells of calyx adaxial surface. n, transverse section of anther. o, transverse section of filament. p, epidermal cells of filament.1, stratum corneum.2, upper epidermal cells.3, lower epidermal cells.4, sponge tissue.5, vascular bundle.6, epidermis.7, fiber layer.8, pollen sacs.9, vascular bundles within the drug compartment.10, medicinal septal thin-walled tissue.
图3PdMYB57 基因扩增及菌落 PCR 电泳图与核苷酸及蛋白序列
Fig.3PdMYB57 gene amplification, electrophoresis map, and nucleotide and protein sequences
A．1-3，PdMYB57基因PCR扩增产物；B．1-9，连接 T 载体的菌落PCR；M. DL2000 DNA marker。
A．1-3, PCR amplification products of PdMYB57. B．1-9, PCR for colonies with T vectors. M. DL2000 DNA marker.
图4PdMYB57蛋白亲疏水性、信号肽及跨膜结构预测
Fig.4Prediction of hydrophilicity, signal peptide, and transmembrane structure of PdMYB57 proteins
A．PdMYB57蛋白各氨基酸占比（%）；B．蛋白亲疏水性预测；C．蛋白信号肽预测；D．蛋白跨膜结构预测。
A．Proportions of amino acids in PdMYB57 protein. B．Prediction of protein hydrophilicity and hydrophobicity. C．Signal peptide prediction. D．Transmembrane structure prediction.
用在线软件 NetPhos对PdMYB57蛋白的磷酸位点进行预测，发现蛋白中高于0.5阈值的磷酸化位点共有 32 个，其中丝氨酸（Ser）磷酸化位点 21 个，苏氨酸（Thr）磷酸位点 10 个以及 1 个酪氨酸（Tyr）位点; 用 GOR在线软件预测 PdMYB57蛋白的二级结构，结果显示 PdMYB57二级结构主要由 α-螺旋、无规则卷曲及延伸链组成，其中α-螺旋占 14.34%，无规则卷曲占63.02%，延伸链占22.64%，不含有β-转角; SWISS-MODEL 预测蛋白三级结构，其 GMQE值为0.61，与牡丹 MYB 转录因子的覆盖度为94.34%，结构模型与二级结构预测结果相符，含有大量无规则卷曲（图5）。
2.4 PdMYB57蛋白功能预测
结果（图6，A）所示，PdMYB57 位于拟南芥 SG6亚组中，而拟南芥SG6亚组被认为是促进植物花青素积累的主要亚组[31]。此外，PdMYB57与卵叶牡丹 PqMYB113、牡丹 PsMYB57/PsMYB58 以及葡萄 VvMYBA1/VvMYBA2 具有高度同源性; 将 PdMYB57 序列与拟南芥 MYBSG6 亚组中的 ATMYB75/90/113/114 以及卵叶牡丹 PqMYB113、牡丹 PsMYB57/PsMYB58、葡萄 VvMYBA1/VvMYBA2等序列进行多序列比对，结果表明 PdMYB57 具有典型的 R2R3 保守结构域[R/K]Px[P/A/R]xx[F/Y]基序，属于 R2R3-MYB 转录因子家族，还包含典型的bHLH 相互作用基序（motif6）、ANDV 基序（图6，B）。综上推测，PdMYB57 基因编码 1 个激活滇牡丹花青素生物合成的 R2R3-MYB 转录因子。
图5PdMYB57蛋白磷酸位点及结构预测
Fig.5Prediction of phosphorating sites and structural changes of PdMYB57 proteins
A．PdMYB57磷酸位点预测；B．蛋白二级结构；C．蛋白三级结构。
A．Prediction of PdMYB57 phosphorating sites. B．Protein secondary structure. C．Protein tertiary structure.
图6PdMYB57序列比对
Fig.6Sequence alignment for PdMYB57
A．PdMYB57系统发育树；B．PdMYB57多序列比对。
A．Phylogenetic tree for PdMYB57. B．Multiple sequence alignment for PdMYB57.
2.5 PdMYB57 基因组织表达模式
qPCR实验表明，PdMYB57 基因在红色花滇牡丹萼片中具有最高的表达量，其次是黄色花滇牡丹叶片，在其余组织中的表达量极低，几乎不表达，这与转录组数据表达趋势一致（图7，A）。HPLC实验表明，滇牡丹各组织中主要含有Cy3G5G、Pn3G5G、 Cy3G 及 Pn3G 等4种花青素（图7，B），在红色花滇牡丹各组织中花瓣具有最高的花青素含量，其次是雄蕊与萼片; 在黄色花滇牡丹各组织中花瓣与雄蕊具有最高的花青素含量，其次是茎和叶，推测 PdMYB57 具有组织表达的特异性，即只在特定组织中进行表达（表2）。PdMYB57 的表达与各组织花青素含量的表达模式存在差异且不具显著相关性（图7，C），但与滇牡丹萼片及叶片中的花青素含量单独分析时表现出显著正相关（图7，D、E），表明 PdMYB57 与滇牡丹萼片及叶片中花青素合成相关。
图7PdMYB57组织表达模式及与滇牡丹花青素含量的相关性分析
Fig.7Expression patterns of PdMYB57 in tissues and correlation analysis with anthocyanin content in P. delavayi
A．PdMYB57基因qPCR表达情况，不同小写字母表示qPCR表达差异显著，不同大写字母表示FPKM值差异显著（P＜0.05）；B．花青素标准品色谱图；C．所有组织花青素含量与qPCR表达相关性热图，*表示差异显著（P≤0.05），下同。D．萼片中花青素含量与qPCR表达相关性热图；E．叶片中花青素含量与qPCR表达相关性热图。
A. qPCR assay of PdMYB57 gene expression. Lowercase letters indicate significant expression difference, uppercase letters indicate significant FPKM difference (P＜0.05) . B. Standard color spectrum of anthocyanins. C. Correlation heatmap of the anthocyanin content and qPCR exression. * represent significant difference (P≤0.05) , the same as below. D. Heat map of the correlation between anthocyanin content in sepals and qPCR expression. E. Heat map of the correlation between anthocyanin content in leaves and qPCR expression.
表2花青素含量
Table2Analysis of anthocyanin contents
注:HB.花瓣; E.萼片; XR.雄蕊; Y.叶; J.茎。—表示未检测到花青素。同行不同小写英文字母表示花青素含量差异显著（P≤0.05）。
Note: HB, petals. E, sepals. XR, stamens. Y, leaves. J, stems. — indicates that anthocyanins are not detected. Lowercase letters in the same line indicate significant difference in anthocyanin content (P≤0.05) .
2.6 PdMYB57 基因的功能验证
阳性对照 AN2 在强光诱导下显示出强烈的紫色，PdMYB57 所诱导产生的颜色较浅，集中于注射的伤口处，而 CK 对照无颜色产生（图8，A、B）。
以 AN2、PdMYB57、CK 瞬时表达后的烟草叶片为材料进行 HPLC实验，结果（图8，C、D）表明在 AN2、PdMYB57 瞬时表达的烟草叶片中能够检测到 Cy3R，且AN2 瞬时表达的烟草叶片中含有最高的 Cy3R 含量，在 CK 烟草叶片中未检测到 Cy3R，表明 PdMYB57 能够促进烟草叶片中花青素的积累，对植物花青素的合成起到正向调控的作用。
图8PdMYB57 基因的瞬时表达
Fig.8Transient expression of PdMYB57
A．PdMYB57瞬时表达烟草叶片；B．PdMYB57瞬时表达烟草叶片黄酮提取液；C．花青素含量柱状图，不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；D．520 nm下花青素色谱图。
A. Transient expression of PdMYB57 in tobacco leaves. B. Flavonoid extract from tobacco leaves transiently expressing PdMYB57. C. Histogram of anthocyanin content. Different lowercase letters represent significant difference (P＜0.05) . D. Chromatogram of anthocyanin at 520 nm.
3 讨论
滇牡丹具有极其丰富的表型变异，尤其是在颜色变化上，因此，滇牡丹是研究植物花青素积累的优良实验材料。滇牡丹植株颜色的丰富性不仅表现在花瓣上，而且在花药、花丝、萼片、茎、叶及叶柄等器官也具有丰富的颜色变化。本研究的红色花滇牡丹植株的花部各器官徒手切片结果表明，在各器官的表皮细胞均有花青素的积累，且红色较深的上表皮细胞中花青素积累最多，有花青素积累的上表皮细胞也较下表皮细胞多，这与 Mudalige等[32]对石斛花颜色强度是由色素在不同表皮细胞层的空间分布决定的研究结果一致，但本文仅对2种花色滇牡丹进行徒手切片，有待增加更多花色的植株开展实验研究。
本文 PdMYB57转录因子的研究显示，它仅在滇牡丹萼片及叶片中高表达，并与萼片及叶片中的花青素含量呈显著正相关，说明具有在特定组织中表达的特征。这一结果与从牡丹（P.suffruticosa）的红叶中克隆得到的同源转录因子 PsMYB57在芽和幼叶中主要表达的结果[21]相似。且它们均与拟南芥中促进花青素积累的 R2R3-MYB转录因子家族SG6亚组聚为一类，也具有典型的 R2R3保守结构域[R/K]Px[P/A/R]xx[F/Y]基序。这一结果与邹红竹等[16]对纯黄色滇牡丹植株的 MYB家族成员的研究认为 PdMYB57属于 MYB-related即 R1/ R2-MYB亚类不一致，这可能是由于滇牡丹植株表型特征不同所致。本试验材料是黄色花（基部带红斑）与红色花的滇牡丹植株，而邹红竹等的试验材料是纯黄色滇牡丹植株。因此，还需继续对PdMYB57 基因在不同花色的滇牡丹植株中的表达情况进行探究，并采用遗传转化实验方法对 PdMYB57 基因功能进一步验证。
本研究以烟草为材料进行 PdMYB57 基因的瞬时表达。结果表明，PdMYB57 基因能够使烟草叶片产生花青素（Cy3R），并呈现出紫色，验证了 PdMYB57 基因具有促进植物花青素合成的功能。但PdMYB57 的工作原理尚不清楚，其能够促进花青素合成是由自身引起还是通过调控花青素生物合成途径中的结构基因; 而花青素结构基因的表达受到 MBW（MYB-WD40-bHLH）复合物的调控[33-36]。所以，PdMYB57是否与其他转录因子联合调控植物花青素的合成，还需要深入开展蛋白杂交试验等对其调控机理进行探究。
4 结论
滇牡丹花青素主要分布在各组织的表皮细胞中，颜色较深的部位花青素分布越多，范围越广; 经过本地序列比对得到1条与牡丹PsMYB57 基因序列相似的PdMYB57 序列，推测其与邹红竹等所鉴定的PdMYB57 为不同序列，经克隆得到PdMYB57 基因具有1个798bp的完整开放阅读框，编码265 个氨基酸，与拟南芥SG6亚族以及牡丹 PsMYB57/ PsMYB58、卵叶牡丹PqMYB113、葡萄 VvMYBA1/ VvMYBA2等促进花青素合成的 MYB转录因子聚为一簇，推测其参与了植物体内花青素的生物合成，并在滇牡丹萼片与叶片中特异表达。对PdMYB57 基因进行瞬时表达，结果显示 PdMYB57 能使烟草叶片产生紫色，并能检测到 Cy3R。综上，表明 PdMYB57 基因编码1个 R2R3-MYB 转录因子，并对植物花青素的合成具有促进作用，可为牡丹的基因育种工作提供数据支持。
