摘要
【目的】通过田间抗病性与室内苗期抗病性联合鉴定和分析,掌握海岛棉种质资源的抗病性分布状况,为筛选出黄萎病的高抗资源提供基础。【方法】以本课题组的238份海岛棉种质资源为鉴定对象,于2023年在库尔勒和阿瓦提通过自然病田小区试验,并联合室内苗期接菌的方法,对海岛棉资源进行黄萎病抗病性鉴定和评价。 【结果】对238份海岛棉种质资源的 15 个指标遗传多样性分析,变异系数范围为 2.00% ~36.97%,均值为 16.05%。于不同环境进行抗性鉴定发现变异系数范围为8.40%~71.06%。结合4个不同环境分析未鉴定到对黄萎病完全免疫及高抗的种质资源材料,鉴定出30份抗病材料,194份耐病材料,14份感病材料。【结论】海岛棉种质资源对大部分黄萎病都具有抗耐性,可从海岛棉种质资源中鉴定和选育对黄萎病抗性强的种质资源。
Abstract
[Objective] Through identification and analysis of disease resistance of the field- and indoor-growing seedlings, the distribution of disease resistance of Gossypium barbadense germplasm resources was mastered, providing a basis for screening high resistant resources to Verticillium wilt. [Methods] 238 G. barbadense germplasm resources of our research group were used as objects. In 2023, the field plot test for the natural disease was carried out in KEL and AWT, and the resistance of G. barbadense resources to V. wilt was identified and evaluated by indoor inoculation. [Results] The genetic diversity of 15 indexes of 238 G. barbadense germplasm resources was analyzed. The coefficient of variation was ranged from 2.00% to 36.97%, with an average of 16.05%. Resistance identification in different environments showed that the coefficient of variation was ranged from 8.40% to 71.06%. Based on the analysis of four different environments, no germplasm resources with complete immunity and high resistance to V. wilt were identified, and 30 resistant materials, 194 resistant materials, and 14 susceptible materials were identified. [Conclusion] Most of the planting resources of G. barbadense have resistance to V. wilt. Therefore, it is necessary to identify and select germplasm resources with strong resistance to V. wilt from G. barbadense germplasm resources.
棉花是天然纤维作物和经济作物,在国民经济中占有举足轻重的地位[1]。其中海岛棉的纤维品质优于其他棉属,为高端纺织提供原料,并且具有抗虫和抗病等其他重要性状[2]。棉花黄萎病是由半知菌亚门中的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染造成的一种土传维管束病害[3-4],目前是棉花病害中严重的病害之一[5],被称为棉花“癌症”,在世界各国的主产棉区均有发生,影响纤维品质并造成棉花产量严重下降,籽棉的产量损失高至7.9% [6]。棉花黄萎病已成为威胁棉花产业绿色可持续发展的重要因素之一[7]。由于大丽轮枝菌具有广泛的寄主范围和土壤传播微菌核的持久性[8],它可以很容易地在不断变化的环境和宿主中生存,在植株上可能会表现相同或者不同的表征,因此给防治黄萎病带来困难[9]。采用化学防治手段不仅无法将黄萎病菌清除干净,还会对环境产生不良影响,因此挖掘对黄萎病具有高抗的种质资源是极为有效的方法[10-11]。但目前在陆地棉中选育出来的种质资源的抗病能力较弱,在对于黄萎病抗性方面还是无法满足现阶段所需,且关于抗性种质资源方面的鉴定和评价较少[12]。前人研究表明海岛棉是目前对黄萎病抗性较强的主要棉属,选择从海岛棉种质资源里挖掘抗病品种是对抗病品种筛选的一种扩展。
于2023年对不同环境的238份海岛棉种质资源进行抗性鉴定,采用室内苗期接种病原菌鉴定联合田间病圃鉴定方法,明确这批资源的农艺性状和病情指数,增加对黄萎病具有抗性的种质资源材料数量,为未来抗病育种提供基础。
1 材料和方法
1.1 供试材料
供试材料为238份海岛棉种质资源,具有强致病力的大丽轮枝菌 V991均由新疆作物遗传改良与种质创新重点实验室提供。
1.2 试验地点与田间设计
试验于 2023 年在新疆库尔勒巴州农科院(87°34'23″E,43°48'55″N)和阿瓦提塔木托格拉克镇(80°01'12.46″E,40°42'19.81″N)的自然病田开展,试验材料采取随机排列,设置2次重复,1膜2行,行长3m,行距0.6m,机械铺膜,人工播种。
1.3 性状调查
于成熟期将种质资源随机选取连续5株,调查株高,始节高,第一果枝节位,有效果枝数,有效铃数等相关指标。
收花后对棉纤维上半部平均长度、伸长率、断裂比强度、整齐度指数、马克隆值等纤维指标进行测定。
1.4 黄萎病抗性鉴定方法
1.4.1 室内接种病原菌鉴定
打孔器经过灭菌打直径0.5cm 的菌饼,用灭菌的枪头挑1块菌饼到马铃薯葡萄琼脂培养基(PDA)上暗培养10d。用经过灭菌消毒的打孔器打直径0.5 cm 的菌饼,灭菌枪头挑8块菌饼到经过121℃高压灭菌的液体察氏培养基(2g NaNO3,0.7g KH2PO4,0.3g K2HPO4,0.5g KCl,0.5g MgSO4,0.01g FeSO4,30g蔗糖,加超纯水定容至1L)中,于28℃下暗振荡培养7d,取出接种时,将纱布折叠至4层过滤 10 7 个/mL大丽轮枝菌菌液。
培养室海岛棉培养过程:将露白的海岛棉种子种植在盛有灭菌土的塑料营养钵中,每钵播种4粒饱满的海岛棉种子,4个生物学重复。用白色透明的薄膜覆盖,在托盘底部倒满自来水,并放置于28℃的恒温棉花培养室的架子上,采用16h光照,8h 暗培养。在棉苗一叶一心期采用灌根法接种 10 7 个/mL大丽轮枝菌孢子悬浮液。
1.4.2 田间病叶鉴定
田间病叶调查是一种常用的调查病情指数的方法,由于所需鉴定的种质资源材料较多,为减小田间误差,需选择肥力相当,地势较平坦的地方,对全小区每株调查,采用5级制进行分级,计算病情指数。
1.4.3 田间剖秆鉴定
在吐絮后期,用截取离地15cm 的棉秆,每个品种选择连续10株进行剖秆,采用5级制进行分级,计算病情指数。
1.5 抗病性调查与评价
海岛棉种质资源进行室内及田间黄萎病菌的侵染,在室内对苗期叶片发病表型进行调查,田间先在铃期病叶调查,再在吐絮期剖秆调查,按照朱荷琴等[13]的5级分类,病情指数分级标准(表1)及棉花黄萎病分级标准(表2),并计算发病率。
根据数据,计算出发病率以及病情指数。发病率=发病株数/总株数×100; 病情指数=∑(病情株数×相应病级)/(总株数×4)×100。
表1病情指数分级标准
Table1Grading criteria for disease index
表2棉花黄萎病分级标准
Table2Grading criteria for cotton V. wilt
1.6 数据分析
用 Excel 2021 和 SPSS 分析并处理数据。用 Origin 2021作图、Adobe Illustrator 2021进行图形编辑。
2 结果与分析
2.1 海岛棉资源主要指标遗传多样性(H')分析
2.1.1 海岛棉资源主要指标描述性统计及遗传多样性分析
238份海岛棉种质主要指标变异情况分析(表3)表明,15个指标的平均变异系数为16.05%,根据变异系数的大小可排序为:整齐度<上半均长<剖秆发病率<强度<马克隆值<株高<皮棉<伸长率<有效果枝数<始节高<有效铃数<病叶发病率<剖秆病情指数<第一果枝节位<病叶病情指数。15 个主要指标的平均多样性指数为1.86,遗传多样性指数(H')的排序为:剖秆发病率<始节高<株高<马克隆值<第一果枝节位<强度<皮棉<有效铃数 <整齐度<上半均长<病叶病情指数<伸长率<有效果枝数<剖秆病情指数<病叶发病率。
海岛棉的株高为53.67~122.97cm,平均株高 75.23cm; 始节高为6.60-25.37cm,平均始节高 12.66cm; 第一果枝节位为1.20~5.60节,平均始节位2.55节; 有效铃数为5.30~17.00个,平均铃数9.29个; 有效果枝数4.40~10.70台,平均果枝数 7.24 台; 库尔勒剖秆发病率为 55.00%~100.00%,平均发病率93.61%; 库尔勒剖秆病情指数为18.75%~60.00%,平均病情指数34.18%; 库尔勒病叶发病率为23.64%~100.00%,平均发病率 72.47%; 库尔勒病叶病情指数为 8.03%~67.14%,平均病情指数 30.50%; 皮棉为 18.08~48.63g,平均皮棉为 35.85g; 上半部平均长度 26.79~38.26 mm,平均上半部平均长度为33.30 mm; 马克隆值2.92~5.82,平均马克隆值为4.13; 断裂比强度 29.32~49.25,平均断裂比强度为 36.11; 整齐度指数为79.06%~89.27%,平均整齐度指数85.46%; 伸长率为5.54%~11.41%,平均伸长率8.08%。
表3海岛棉资源主要指标描述性统计及遗传多样性分析
Table3Descriptive statistics of agronomic traits and genetic diversity analysis of G. barbadense resources
2.1.2 海岛棉资源主要指标相关性统计分析
通过 Pearson积矩阵相关系数分析238份海岛棉种质资源主要指标的相关性(表4),15个主要指标中,株高与始节高、第一果枝节位、有效铃数、马克隆值、整齐度指数、断裂比强度之间呈极显著正相关,与病叶病情指数、伸长率之间呈显著负相关; 始节高与第一果枝节位、有效铃数、马克隆值、整齐度指数、断裂比强度呈显著正相关,与有效果枝数、病叶发病率、病叶病情指数之间呈显著负相关; 第一果枝节位与有效铃数、马克隆值呈显著正相关,与有效果枝数、病叶发病率、病叶病情指数呈显著负相关; 有效铃数与有效果枝数、皮棉、伸长率呈显著正相关,与病叶发病率,病叶病情指数、上半部平均长度、整齐度指数、断裂比强度呈显著负相关; 有效果枝数与皮棉呈正相关,与剖秆病情指数呈显著负相关; 剖秆发病率与剖秆病情指数呈极显著正相关; 剖秆病情指数与病叶发病率、病叶病情指数呈极显著正相关,与马克隆值呈负相关; 病叶发病率与病叶病情指数、上半部平均长度、整齐度指数、断裂比强度呈极显著正相关,与伸长率呈负相关,病叶病情指数与断裂比强度呈极显著正相关,与伸长率呈极显著负相关; 皮棉与上半部平均长度、整齐度指数呈负相关; 马克隆值与上半部平均长度呈负相关; 上半部平均长度与整齐度指数、断裂比强度呈显著正相关,与伸长率呈负相关; 整齐度指数与断裂比强度呈显著正相关,与伸长率呈负相关; 断裂比强度与伸长率呈极显著负相关。
表4海岛棉主要指标相关性分析
Table4Correlation analysis of agronomic traits in G. barbadense
注:**表示在0.01水平(双侧)上显著相关,*表示在0.05水平(双侧)上显著相关。下同。
Note: ** indicates significant correlation at the 0.01 level (two-sided) and * indicates significant correlation at the 0.05 level (two-sided) . The same as below.
2.1.3 海岛棉资源主要指标主成分分析
主成分分析结果(表5)显示,当特征值 >1.0 时,238份海岛棉种质资源的15个主要指标,共提取到5个主成分,第1主成分的特征值为3.240,贡献率为21.602%,累计贡献率达21.602%,第2主成分的特征值为3.038,贡献率为20.250%,累计贡献率达41.853%,第3主成分的特征值为1.739,贡献率为11.591%,累计贡献率达53.444%,第4主成分的特征值为1.488,贡献率为9.919%,累计贡献率达63.363%,第5主成分的特征值为1.426,贡献率为9.504%,累计贡献率达72.867%,说明前5个主成分能够有效的代表海岛棉主要指标的大部分信息。
表5海岛棉主要指标的主成分因子的方差贡献率
Table5Variance contribution of principal component factors for agronomic traits in G. barbadense
2.1.4 海岛棉资源主要指标聚类分析
根据15个主要指标对238份海岛棉种质材料进行聚类分析,划分为4大类群(图1)。类群I包含 DC1和 DC128共2个品系,占比0.84%; 类群Ⅱ包含 DC100、DC79等118个品系,占比49.58%; 类群 Ⅲ包含 DC63、DC53等117个品系,占比49.16%,类群Ⅳ包含 DC71这1个品系,占比0.42%。
2.2 海岛棉不同环境抗黄萎病种质筛选
2.2.1 海岛棉不同环境病情指数描述性统计分析
对238份海岛棉种质资源的不同环境的发病率和病情指数进行描述性统计分析,由表6可知,库尔勒剖秆发病率为55.00%~100.00%,平均发病率 93.61%,变异系数8.40%; 库尔勒剖秆病情指数为 18.75%~60.00%,平均病情指数34.18%,变异系数23.87%; 阿瓦提剖秆发病率为0~85.00%,平均发病率30.21%,变异系数62.00%; 阿瓦提剖秆病情指数病情指数为 0~38.75%,平均病情指数 8.18%,变异系数 71.06%; 库尔勒病叶发病率为 23.64%~100.00%,平均发病率72.47%,变异系数22.22%; 库尔勒病叶病情指数为 8.03%~67.14%,平均病情指数30.50%,变异系数36.97%; 室内苗期发病率为6.25%~100.00%,平均病情指数55.57%,变异系数36.39%; 室内苗期病情指数为1.56%~87.50%,平均病情指数32.77%,变异系数41.24%; 比较不同环境的变异系数发现,阿瓦提剖秆病情指数的变异系数最大,为71.06%。库尔勒剖秆发病率的变异系数最小,为8.40%,表明库尔勒剖秆发病率差异不大。
图1海岛棉主要指标聚类分析
Fig.1Cluster analysis of agronomic traits in G. barbadense
表6海岛棉不同环境病情指数描述性统计分析
Table6Descriptive statistical analysis of disease indices of G. barbadense in different environments
2.2.2 海岛棉资源不同环境病情指数相关性分析
对238份海岛棉种质资源的不同环境的发病率和病情指数进行相关性分析,由表7可知,库尔勒剖秆发病率与库尔勒剖秆病情指数呈极显著正相关; 库尔勒剖秆病情指数与库尔勒病叶发病率、库尔勒病叶病情指数和室内苗期病情指数呈极显著正相关,与室内苗期发病率呈显著正相关; 阿瓦提剖秆发病率与阿瓦提剖秆病情指数呈极显著正相关,与库尔勒病叶发病率、库尔勒病叶病情指数呈极显著负相关; 阿瓦提剖秆病情指数与库尔勒病叶发病率、库尔勒病叶病情指数呈极显著负相关,库尔勒病叶发病率与库尔勒病叶病情指数、室内苗期发病率、室内苗期病情指数呈极显著正相关; 库尔勒病叶病情指数与室内苗期发病率、室内苗期病情指数呈极显著正相关; 室内苗期发病率与室内苗期病情指数呈极显著正相关。
表7海岛棉资源不同环境病情指数相关性分析
Table7Correlation analysis of different environmental disease indices of G. barbadense resources
2.2.3 海岛棉不同环境病情指数聚类分析
根据不同环境的病情指数对238份海岛棉种质材料进行聚类分析,划分为4大类群(图2)。类群Ⅰ 包含 DC165、DC76等61个品系,占比25.63%,类群 Ⅱ包含 DC169、DC49等162个品系,占比68.07%; 类群 Ⅲ 包含 DC28、DC87等13个品系,占比5.46%,类群 Ⅳ 包含DC231和DC118共2个品系,占比0.84%。
2.2.4 海岛棉筛选极端材料表型图
库尔勒病叶和剖秆调查结果,阿瓦提剖秆调查结果联合室内苗期接菌结果分析,筛选出5份感病材料(图3、图5)和5份抗病材料(图4、图6),进行表型拍照。
图2海岛棉不同环境病情指数聚类分析
Fig.2Cluster analysis of different environmental disease indices of G. barbadense
图3极端感病材料在田间发病情况
Fig.3The incidence of extreme susceptible materials in the field
图4极端抗病材料在田间发病情况
Fig.4Incidence of extreme disease-resistant materials in the field
图5室内接菌感病表型极端材料
Fig.5Materials with the extreame phenotype of indoor inoculated susceptibility disease
图6室内接菌抗病表型极端材料
Fig.6Materials with the extreme phenotype for indoor bacterial and disease resistance
2.2.5 不同环境点对黄萎病抗性结果鉴定
2023年4个不同环境供试海岛棉种质资源抗黄萎病鉴定结果如图7所示:库尔勒10月剖秆:供试的238份海岛棉种植资源中未鉴定出对黄萎病具有免疫及高抗的种质资源材料,4份抗病种质资源材料,136份耐病种质资源材料,其余为感病种质资源材料。阿瓦提10月剖秆,供试的238份海岛棉种质资源中有15份对黄萎病免疫种质资源材料,159 份高抗种质资源材料,59份抗病种质资源材料,4份耐病种质资源材料,1份感病种质资源材料。库尔勒8月病叶调查,供试的238份海岛棉种植资源中未鉴定到对黄萎病免疫种质资源材料,2份高抗种质资源材料,37份抗病种质资源材料,129份耐病种质资源材料,70份感病种质资源材料。室内苗期接种黄萎病菌,供试的238份海岛棉种植资源中未鉴定到对黄萎病免疫材料,10份高抗种质资源材料,25份抗病种质资源材料,109份耐病种质资源材料,94份感病种质资源材料。
图7不同环境病级
Fig.7Disease levels in different environments
3 讨论
种质资源是种业创新的基础,棉花种质资源是培育棉花新品种的基础材料。棉花黄萎病是一种世界性的真菌病害,严重威胁世界各地棉花产量,选育对黄萎病具有高抗的品种是解决棉花黄萎病的最经济有效的途径。抗病种植资源的挖掘与鉴定是开展抗病育种研究的基础,与此同时抗病性鉴定方法是为了更加准确地鉴定出抗病种质资源,马清倩等[14] 对乌兹别克斯坦引进的18份抗黄萎病种质资源于玛纳斯棉花育种基地专用病圃鉴定,发现抗病材料 6份,占总鉴定材料的33.33%,耐病材料8份,占总鉴定材料的44.44%,感病材料4份,占总鉴定材料的22.22%。单莹等[15]对2009—2019年参加辽宁省棉花区域试验的100品系进行枯萎病、黄萎病的抗性鉴定,结果发现,这100份品系对黄萎病的抗性较差,未鉴定到对棉花黄萎病免疫的品系,但鉴定到高抗和抗黄萎病品系占55.0%。赵丽红等[16]对河南省棉花区域试验的244份品系采用人工病圃成株期鉴定抗枯萎病、黄萎病抗性品种,结果未鉴定到高抗棉花黄萎病品种,且抗病材料所占比例为2.1%~30.6%; 耐黄萎病品种(系)所占比例较高,为55.5%~88.6%,感黄萎病品种(系)的比例分别为5.7%、 24.2%、13.9%、10.4%和15.6%。结果表明,近年河南省区试参试棉花品种(系)对黄萎病的抗性为中等,主要是耐黄萎病材料。赵沛等[17]对2016—2019 年87份参加江西省棉花品种区域试验的材料采用室内苗期鉴定法和大田病圃鉴定法相结合进行抗病鉴定,结果表明,参加测试品系分为抗病材料和耐病材料,但还是未鉴定到对棉花黄萎病免疫及高抗的材料。邓亚辉等[18]以从中国黄河流域植棉区、长江流域植棉区、西北内陆植棉区、北部特早熟(辽宁省)棉区以及国外引种收集的106份棉花种质资源材料为鉴定对象,在室内采用无纺布育苗袋伤根蘸菌法联合大田多年混生病圃联合鉴定,结果发现32份高抗材料,占总体材料的30.2%; 35 份抗病材料; 30 份耐病材料; 7 份感病材料; 2 个免疫材料。陈斌等[19]对从中国、美国、澳大利亚、巴基斯坦、巴西、保加利亚、法国、墨西哥、日本、苏丹、前苏联、俄罗斯、乌兹别克斯坦、土耳其、乌干达、西班牙、乍得等国家收集到的419份陆地棉核心种质资源采用六棱塑料钵定量注射菌液法鉴定,结果发现12份抗病材料,耐病材料253份,154份感病材料,但在此次鉴定中未鉴定要对棉花黄萎病具有免疫及高抗的材料。程利华等[20]对10份陆地棉种质进行室内六棱塑料钵定量注菌液法以及大田自然病圃联合鉴定,结果筛选出1份抗病、5份耐病和4份易感病的陆地棉种质。曹阳等[21]对396份种质资源,在自然病圃进行连续2年的抗病鉴定,结果表明,2019年发病情况比2018年低,根据8月底统计的相对抗性指数,抗病材料有105份,耐病材料有108 份,感病材料有 183份。陈辅志等[22]对9个棉花资源进行抗黄萎病鉴定,结果未鉴定到高抗品种,感病材料少于抗病材料。
以上对陆地棉种质资源鉴定发现陆地棉中缺乏抗黄萎病资源,也是阻碍种质资源抗黄萎病育种的根本原因之一。前人研究鉴定结果表明,在中国的各大棉区都有黄萎病的发生,并逐年加重,当前各地的育种家们也在不断地从陆地棉中鉴定现有种质资源和培育新种质资源,但陆地棉因本身对黄萎病的抗性较弱,所以很难从现有的陆地棉种质资源中鉴定出对棉花黄萎病具有免疫及高抗的材料,与陆地棉不同的是海岛棉抵御黄萎病菌方面就有抗性[23],从海岛棉中挖掘出抗病材料可以作为一条新思路。对于棉花抗黄萎病的鉴定方法而言,前人大多采用单一鉴定方法,很少考虑到植物种质资源表型性状的评价过程易受自然因素和人为因素的影响[24-25],本试验采用大田自然病圃和室内苗期接菌法联合鉴定这238份海岛棉种质资源,首先弥补了自然病圃可能存在发病不一致的情况,而室内接菌大丽轮枝菌 V991,菌株致病过于单一,两者的结合互相弥补使鉴定结果更为准确。
4 结论
(1)将238份海岛棉种质资源的15个指标遗传多样性分析,变异系数范围为2.00%~36.97%,均值为16.05%,其中病叶病情指数的变异系数最大,整齐度指数的变异系数最小,反映了不同种质材料数量性状间存在一定差异,具有丰富的遗传多样性,主成分分析结果表明,共提取到5个主成分,说明前 5个主成分能够有效地代表海岛棉主要指标的大部分信息。聚类分析将238份海岛棉种质资源的主要指标分为4个类群,类群Ⅰ包含 DC1和 DC128这2 个品系,占比0.84%; 类群Ⅱ 包含 DC100、DC79 等 118个品系,占比49.58%; 类群Ⅲ包含 DC63、DC53 等117个品系,占比49.16%,类群Ⅳ包含 DC71这 1个品系,占比0.42%。
(2)将238份海岛棉种质资源材料于不同环境进行黄萎病抗性鉴定,进行遗传多样性分析,变异系数范围为8.40%~71.06%,均值为37.77%,其中阿瓦提剖秆病情指数的变异系数最大,其中库尔勒剖秆发病率变异系数最小,反映了不同种质材料数量性状间存在一定差异,具有丰富的遗传多样性,聚类分析将不同环境鉴定的238份海岛棉种质资源的病情指数和发病率分为4个类群,结合4个不同环境分析未鉴定到对黄萎病完全免疫及高抗的种质资源材料,但鉴定出30份抗病材料,194份耐病材料,14份感病材料。
(3)虽没有在多环境下找到对黄萎病免疫的材料,但是从整体趋势可以看出海岛棉种质资源对大部分黄萎病都具有抗耐性,因此从海岛棉种质资源中鉴定和选育出对黄萎病抗性强的种质资源十分重要。