党参人工高效快速繁殖体系的建立
doi: 10.7606/j.issn.1000-4025.20240155
高金荣 , 任艳 , 李怡萌 , 黄衡宇
云南中医药大学,云南省道地濒危中药材繁育与栽培工程技术研究中心,昆明 650500
基金项目: 云南省禄劝县中药材产业科技特派出团项目(202204BI090007) ; 云南省道地濒危中药材繁育与栽培工程技术研究中心项目(2016DH011)
Establishment of an efficient and rapid artificial propagation system for Codonopsis pilosula
GAO Jinrong , REN Yan , LI Yimeng , HUANG Hengyu
Yunnan Breeding and Cultivation Research and Development Center of Endangered and Daodi Chinese Medicinal Materials, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500 , China
摘要
【目的】 研究党参离体再生条件,建立其人工高效快速繁殖体系,为党参种苗繁育提供理论依据。【方法】通过茎尖和茎段在不同外源激素组合中诱导愈伤组织,再引入椰子汁与6-BA、NAA和KT进行L16(45)正交实验,筛选出最佳外植体及不定芽的分化和增殖培养基,最后在瓶外实现生根和炼苗。【结果】(1)茎段在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA中的愈伤组织诱导率高达98.76%,而茎尖只有76.56%;(2)椰子汁对党参增殖具有显著影响,在MS+60 mL/L椰子汁+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA中的增殖系数可达43.39;(3)再生芽的瓶内生根率极低,而瓶外生根的再生芽30 d后即可形成根系,生根率达87.96%,移栽后存活率为97.73%。此外,在愈伤组织诱导和分化过程中出现基茎丛生芽和腋芽,这也大大提高了党参的增殖系数。【结论】茎段更适合诱导愈伤组织,椰子汁促进愈伤组织再分化,瓶外生根大大提高了生根率。
Abstract
[Objective] The study aims to explore the in vitro regeneration condition of Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. and establish an efficient and rapid propagation system to provide a basis for its seedling breeding. [Methods] The callus was induced by stem tips and stem segments in different hormone combinations, and then the L16 (45) orthogonal experiment was carried out with coconut juice, 6-BA, NAA, and KT to screen the best explant and the differentiation and proliferation medium for adventitious buds. Finally, the rooting and acclimatization of plantlets were realized outside the bottle. [Results] (1) The callus induction rate of the stem segments in MS medium with 6-BA of 1.5 mg/L and NAA of 0.5 mg/L was up to 98.76%, while that of the tips was only 76.56%. (2) Coconut juice had a significant effect on the proliferation of C. pilosula, and the proliferation coefficient reached 43.39 in MS medium with 60 mL/L coconut juice, 1.5 mg/L 6-BA, 0.5 mg/L KT, and 0.5 mg/L NAA. (3) The rooting rate of the regenerated buds in bottles was low, but the regenerated buds formed roots outside the bottle after 30 days, with a rooting rate of 87.96%. The survival rate after transplanting was 97.73%. In addition, the basal stem cluster buds and axillary buds appeared during callus induction and differentiation, which greatly improved the proliferation coefficient of C. pilosula. [Conclusion] The stem segment is more suitable for callus induction. Coconut juice promotes callus redifferentiation. Rooting outside the bottle significantly improves rooting rate.
党参[Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.]是桔梗科(Campanulaceae)党参属(Codonopsis)多年生草质藤本植物,生长于海拔1 560~3 100 m的山地林边及灌丛中[1]。党参被中国、日本和韩国等亚洲国家用于食品和民间医学已有几千年的历史[2]。党参、素花党参[C. pilosula Nannf. var. modesta(Nannf.)L. T. Shen]和川党参(C. tangshen Oliv.)的干燥根被《中国药典》收录,共同组成中药党参的基原植物。中医传统医学认为这3种植物的干燥根具有健脾益肺、养血生津的功效,可以治疗脾肺气虚、咳嗽虚喘、气血不足等病症[3]。党参根中的皂苷、多糖、三萜、生物碱等多种次生代谢产物使党参具有多种药理活性,包括免疫调节、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗炎等功能[24]。独特的生物活性和无毒性使党参在药用和食用中颇受欢迎。因党参生物活性与人参相似且价格便宜,故党参也常常被作为人参(Panax ginseng C. A. Mey.)的替代品,《中国药典》记录了100多种含有党参根或根提取物的中药制剂;同时,党参中还含有蛋白质、维生素、矿物质等营养成分,经常以保健品的形式出现在民间,尤其用来煲汤、制茶、煮粥和泡酒等[24-5];此外,党参地上部分中的大量化学成分类型与地下部分相同,可以加工为饲料出售,且叶片中的抗氧化活性、蛋白质、氨基酸、总黄酮和总多酚水平要高于地下部分[5]。这种全草都具有商业价值的药用植物会有巨大的市场潜力。
中国各地都有记载党参的用药历史,其广泛的用途使国内外市场对党参的需求大大增加,而无节制的采挖减少了党参的自然种群,亟需对这种重要的药用植物进行人工繁殖方面的研究[6]。党参在中国各地都有栽培,种子繁殖仍然是主要的繁殖方法。异种自由授粉、疾病传播和栽培环境的改变容易使党参传统种子繁殖产生低质量和低产量的后果。同时,党参种子极小,极易产生变异,种子种苗流通加速种质性状多元化,且需要育苗1年才能移栽,耗时耗力[6-7]。此外,党参属有46种植物,其中39种在中国,而除了药典中的3种植物外,还有17种植物被经常用作党参[2]。品种繁多、种质混杂使党参拥有丰富的遗传多样性,给党参的基因工程研究奠定了基础。然而,高效的植物再生体系是遗传转化实验成功的先决条件[8]。因此,需要一种快捷和高效的方法获得大量遗传稳定的种苗,而组织培养是大规模生产优质党参的一种可持续方案。
组织培养技术已经作为一种保护手段应用于世界各地的大量稀有或濒危药用植物[9]。对于天然稀有和生长缓慢的药用植物,组织培养能为药用植物活性成分的大规模生产提供一种成本效益高、可持续且控制良好的手段,并且利用微繁殖能够使药用植物种源标准化种植成为可能[9]。在药用植物的开发与利用中,组织培养技术具有巨大潜力,而植物基因型、培养基、外植体类型和植物生长调节剂是植物人工体外繁殖成功的主要因素。目前,在党参组织培养的国内外研究中,体细胞胚和原生质体都能够实现党参再生,但却缺少实质性的数据[10-11]。下胚轴、茎段和茎尖都可以作为外植体诱导愈伤组织,并通过对愈伤组织不定芽的诱导实现党参的间接再生[11-12]。同时,也有学者以茎尖为外植体筛选出MS是最适合党参生长的培养基,并通过顶端芽的增殖建立了直接再生体系[13]。此外,也有报道表明党参休眠芽和腋芽可以被诱导并增殖实现体外再生[614]。虽然已有党参组织培养的报道,但主要集中在愈伤组织再分化途径且增殖系数并不高,对党参的再生途径研究不够彻底,尤其是关于直接器官途径并未提供有力数据,也缺乏相应的图片支撑其研究结果。鉴此,该研究以党参茎尖和茎段为外植体诱导愈伤组织并筛选最佳外植体,引入椰子汁设计正交实验对愈伤组织再分化培养基进行改良,明确党参高效繁殖培养基的主要影响因素,并采用瓶外扦插生根的方法为党参再生芽提供另一条生根途径,为下一步党参基因工程研究提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
20株健壮的党参植株由中国云南风和树里生物科技有限公司程麟辉先生提供,带盆移栽于云南中医药大学中药材优良种苗繁育工程研究中心实验大棚中(102°49′21″E,24°50′13″N,海拔1 878.3 m),植株经云南中医药大学黄衡宇教授鉴定为党参[C. pilosula(Franch.)Nannf]。
研究均以MS为基本培养基,萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid,NAA)、激动素(kinetin,KT)、6-苄氨基嘌呤[N-(phenylmethyl)-9H purin-6-amine,(6-BA)]和吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)均为分析纯,同蔗糖和琼脂一起购自北京鼎国生物科技技术有限公司,椰子汁取自新鲜椰子内的果汁。
除特殊说明外,所有激素浓度均为质量浓度,MS培养基中蔗糖添加量为3%,琼脂添加量为0.47%,pH为5.6~5.8,高压灭菌锅121℃灭菌22 min,备用。
1.2 外植体制备
茎尖和茎段(每个材料1~2个节,3~4片叶)流水冲洗30 min,置于超净工作台,0.1%升汞(HgCl2)水溶液(W/V)处理6~10 min,最后无菌水冲洗3次,每次不少于3 min;置于无菌吸水纸上,吸干其表面水分后用无菌手术刀将材料茎的伤口处切去0.2 cm,随后分别按生理方向垂直接入启动培养基(采用MS+1.0 mg/L NAA)中培养,观察并记录生长情况。培养室温度控制在(23±2)℃,光照时间8 h/d,光照强度为1 500~2 000 lx。
1.3 愈伤组织诱导实验
由无菌体系繁殖的茎尖和茎段(每个材料1~2个节,1~2片叶)分别接入6-BA(1.0,1.5,2.0 mg/L)和NAA(0.1,0.5,1.0 mg/L)的完全组合中进行实验,测试2种外源激素的不同浓度组合对愈伤组织诱导的影响,培养期间观察材料生长情况,并于30 d后统计各处理组的愈伤组织诱导率。每个处理重复3次,每组接种3瓶,每瓶接种10个材料。
1.4 增殖实验
将诱导出的愈伤组织团块剪切为0.5 cm×0.5 cm大小,选取椰子汁(CJ):20,40,60,80 mL/L;NAA:0.10,0.50,1.00,1.50 mg/L;6-BA:0.50,1.00,1.50,2.00 mg/L;KT:0.05,0.10,0.50,1.00 mg/L为因素设计L16(45)正交实验(表1),进行愈伤组织不定芽的分化。切好的愈伤团块被分别接入各处理组,30 d后观察并记录生长情况,统计增殖系数。每个处理重复3次,每组接种3瓶,每瓶接种10个材料。
1L16(45)正交增殖实验设计
Table1L16 (45) orthogonal design for the proliferation assay
1.5 瓶外生根实验
将经高温灭菌的基质(泥炭土∶珍珠岩=3∶1)装入泡沫箱(内径长、宽、高依次为26,16,15 cm),基质厚度为4~6 cm,用无菌水将基质浸湿备用。将高1.0 cm左右的单株不定芽接入增殖培养基,待培养瓶中的单株再生芽高度长至2~3 cm时,不论生根与否,均将再生芽取出,在0.5 mg/L的IAA溶液中浸泡3 min,随后轻轻插入基质中,在植株表面轻喷无菌水,最后用透明膜将泡沫箱封口,置于阴凉有光的地方培养,10 d左右进行1次喷水,泡沫箱内温度为20~25℃,湿度在80%左右,30 d后观察植株生长情况,统计生根率并将生根植株移栽至育苗袋,20 d后统计存活率。
1.6 数据处理
每个处理组的结果被量化为平均值±标准误差,采用SPSS 26.0软件进行方差分析(ANOVA)和邓肯检验(Duncan's test),以0.05显著性水平(P≤0.05)确定每种处理方法之间的显著性差异。各阶段数据计算方法为:愈伤组织诱导率=形成愈伤组织的材料数/起始接入材料数×100%;生根率=产生不定根的材料总数/起始插入材料总数×100%;存活率=存活植株总数/移栽植株总数×100%;增殖系数=可作为增殖材料的不定芽数/起始接入材料数。
2 结果与分析
2.1 无菌体系的建立
经过灭菌处理的茎尖和茎段接入启动培养基培养。生长10 d后茎尖节上生长出绿色的芽(图1,A),20 d后茎尖顶端芽伸长,基部节上的腋芽伸长(图1,B),30 d后茎尖基部腋芽具有明显的节(图1,C);培养10 d后茎段腋芽明显(图1,D),随后茎段的腋芽生长速度较快,节间明显(图1,E、F),无菌体系成功建立。
1无菌体系的建立
Fig.1Establishment of the aseptic system
A-C.茎尖;D-F.茎段;A,D.培养10 d;B,E.培养20 d;C,F.培养30 d。标尺为1.5 cm。
A-C. Stem tips. D-F. Stem segments. A, D.10 days of culture. B, E.20 days of culture. C, F.30 days of culture. Scale bars indicate 1.5 cm.
2.2 愈伤组织诱导结果
完全组合实验结果见表2,茎段比茎尖更适合诱导愈伤组织。对于茎尖和茎段,当6-BA浓度不变时,愈伤组织诱导率随着NAA浓度升高呈现出先升高后下降的趋势,当NAA保持在低浓度时,诱导率随着6-BA浓度升高而升高。
2茎尖和茎段愈伤组织诱导实验结果
Table2Experimental results of callus induction from the stem tips and segments
注:表中同列不同字母表示在0.05水平上差异显著。
Note: Different letters in the table indicate significant differences at the 0.05 level.
高浓度的6-BA搭配低浓度的NAA能诱导出大量的愈伤组织,以MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA最适合诱导愈伤组织,茎段愈伤组织诱导率高达98.76%。在此组合中,茎尖和茎段的基部伤口处会形成黄绿色的愈伤组织,茎段能形成更大的愈伤组织团块(图2,A、B);随着培养时间增加,愈伤组织会持续变绿,并在表面形成少许绿色的芽点(图2,C、D)。
2.3 增殖实验结果
由于完全组合实验只能产生大量翠绿色愈伤组织,无法正常分化为不定芽,在随后引入椰子汁的正交实验中发现,愈伤组织会持续增长并且不定芽分化旺盛,大大提高党参的增殖系数。正交实验(表3)及其分析结果(表4)表明,椰子汁对增殖系数的影响最大,其次是6-BA、KT和NAA。4个因素对于增殖系数的影响都大于空白列,表明4个因素都具有可靠效应。根据方差分析结果(表5),椰子汁对于党参的增殖具有显著影响(P<0.05),6-BA、KT和NAA则无显著影响(P>0.05)。通过均值分析,党参增殖的最佳组合为A3B2C3D3,即60 mL/L椰子汁+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA,增殖系数高达43.39。在此组合中,愈伤组织团块培养5 d后能够明显看到不定芽(图2,E);10 d后愈伤组织持续增多,不定芽继续生长(图2,F),随着培养时间增加,不定芽生长茂盛,充满培养瓶底部(图2,G、H)。
此外,在转接过程中发现茎段基部节上会形成丛生芽(图2,I),并在后期的愈伤组织分化的不定芽中亦能够形成腋芽(图2,J)。这2种直接器官发生途径大大提高了党参的有效增殖系数。
2愈伤组织诱导及增殖实验结果
Fig.2The results of callus induction and proliferation experiment
A.茎尖形成的愈伤组织;B.茎段形成的愈伤组织;C-D.翠绿色的愈伤组织;E.愈伤组织开始分化不定芽; F.愈伤组织持续分化出的不定芽;G.生长20 d的不定芽;H.生长30 d的不定芽;I.愈伤组织诱导过程中出现的基茎丛生芽;J.愈伤组织不定芽形成的腋芽。标尺为1.5 cm。
A. Callus formed by stem tips. B. Callus formed by stem segments. C-D. Emerald green callus. E. Callus began to differentiate into adventitious buds. F. Adventitious buds continuously differentiated from callus. G. Adventitious buds growing for 20 days. H. Adventitious buds growing for 30 days. I. Cluster buds of basal stems appeared in the process of callus induction. J. Axillary buds formed by adventitious buds of callus. Scale bars indicate 1.5 cm.
3L16(45)正交增殖实验结果
Table3The L16 (45) orthogonal result of proliferation coefficient
2.4 瓶外生根实验结果
在试管苗生根实验中,尽管采用各种基本培养基和改变附加激素种类及浓度,但在所有处理组中再生芽的生根率极低,在生根过程中,再生芽基部叶片黄化脱落,甚至在伤口处出现愈伤组织(图3,A、B)。因此,本课题组考虑瓶外生根,待培养瓶中的再生芽长高至2~3 cm时,插入基质中保温保湿培养(图3,C、D)。泡沫箱培养20 d后再生芽明显伸长(图3,E);30 d后植株形成根系,生根率高达87.96%(图3,F),移栽至育苗袋培养20 d后植株生长茂盛,根系发达,存活率为97.73%(图3,G、H)。结果表明,瓶外生根实验成功且大大优于瓶内生根。
4增殖系数的均值和区间结果
Table4Results of mean and range in proliferation coefficient
注:K.均值; R.极差(R=Kmax-Kmin);POSF.因素的主次顺序。
Note: K, mean. R, range (R=Kmax-Kmin) . PSOF, primary and secondary order of factors.
5增殖系数的方差分析结果
Table5Variance analysis of proliferation coefficient
3生根实验结果
Fig.3Rooting experiment results
A.生根培养基中的植株;B.瓶内生根植株的不定根及基部愈伤组织;C.单株生长的再生芽;D.泡沫箱培养10 d后的再生芽; E.泡沫箱培养20 d后的再生芽;F.泡沫箱培养30 d后的再生植株;G-H.育苗袋培养20 d后的再生植株及根系。标尺为1.5 cm。
A. Plantlets in rooting medium. B. Adventitious roots and basal callus formed from plantlets. C. Regenerated buds growing alone. D. Regenerated buds after 10 days of foam box culture. E. Regenerated buds after 20 days of foam box culture. F. Regenerated plants after 30 days of foam box culture. G-H. Regenerated plants and roots after 20 days of seedling bag culture. Scale bars indicate 1.5 cm.
3 讨论
叶片、茎尖、茎段、下胚轴和根都是体外再生中经常采用的外植体。课题组预期通过间接器官途径和直接器官途径对党参体外再生进行研究,即叶片诱导愈伤组织,茎尖和茎段诱导腋芽。然而,党参叶片在培养过程中逐渐黄化死亡,不会产生愈伤组织,茎尖和茎段的切口处却产生了愈伤组织。愈伤组织的出现是植物的一次自我革新,它们必须放弃已经建立的完整形态,并再次开始新的分化生长。生长素、细胞分裂素和伤口损伤都能够诱导愈伤组织,生长素或细胞分裂素能激活核心细胞周期调节因子(细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶),使愈伤组织在形成过程中重新获得细胞增殖能力,伤口的出现诱导并上调某些创伤基因(如RAP2.4)而形成愈伤组织,且这类愈伤组织会持续保持增殖能力[15-16]。叶片是诱导愈伤组织的一种常见外植体,且有报道表明生长28 d后的党参叶片具有很高的愈伤组织诱导率[17-18]。然而,本试验中幼嫩或成熟的叶片在完整或损伤的情况下都难以脱分化,在党参的其他体外再生研究中也鲜见叶片诱导愈伤组织的报道[10-14]。出现这种现象可能与党参的自然落叶和倒苗现象(地上部分冬天枯萎,来年春天基部又萌发新枝)有关,当叶片脱离植株,叶片中的内源激素含量就会急剧下降,失去细胞重编程能力。而在以茎段为材料的诱导中,由于其失去了顶端优势的抑制,内源生长素与细胞分裂素之比要低于茎尖,再加上创伤使得细胞分裂素在伤口处加速合成,而较高的细胞分裂素促使伤口形成愈伤组织,这也是茎段愈伤组织诱导率高于茎尖的原因,这种现象在一些植物中也有类似报道[1619]。同时,这种现象也进一步表明同一种植物中不同器官的脱分化和再分化能力不同。此外,本研究还发现党参亦能通过直接途径产生再生芽,茎段基部节上会出现基茎丛生芽,再生芽顶端芽的增殖及节上会形成腋芽,这种增殖方式大大增加了党参的繁殖效率。在阳春砂(Amomum villosum Lour.)和黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)中也报道了茎基部的节上会膨大并形成基茎丛生芽,是一种直接器官途径[20-21]。同时,在党参再生体系的研究中,直接途径仅表现在顶端芽增殖和偶见的腋芽,而丛生芽并无有力证据表明来自于直接器官途径[614];但在同科同属植物管钟党参(C. bulleyana Forrest ex Diels)中却报道了腋芽增殖途径[22]。因此,关于党参直接器官再生途径的机理值得进一步研究。
生长素和细胞分裂素是迄今为止在愈伤组织形成和随后的器官再生背景下使用和研究最广泛的激素,本研究也证实了生长素和细胞分裂素的协同作用对党参愈伤组织的形成至关重要。在一些报道中认为利用2,4-D刺激植物组织细胞分裂并强烈抑制器官发生的特性能够有效地诱导大多数植物的愈伤组织形成[23-24]。本研究采用6-BA搭配NAA的高细胞分裂素比成功诱导了党参愈伤组织,这在藠头(Allium chinense G.Don)和黑种草(Nigella sativa L.)中有过报道,但也有研究报道了高生长素搭配低细胞分裂素利于愈伤组织形成,表明不同物种对外源激素的敏感度不同[2325-26]。椰子汁因其具有促进细胞分裂和快速生长的生长调节特性和细胞分裂素活性而被广泛用于植物组织培养[27]。本课题组先以6-BA、NAA和KT为因素进行L9(34)正交实验,但在所有处理组中愈伤组织再分化效率并不高,增殖系数只有19.36,随后在引入椰子汁的正交实验中发现愈伤组织会持续增长并且不定芽分化旺盛,大大提高了党参的增殖系数,表明椰子汁对党参的增殖具有显著影响。体外细胞和组织培养物的特征在于将植物的分离部分保存在合适的营养培养基中,这种营养培养基的作用是替代最初与外植体相邻的细胞、组织或导电元件[28]。椰子汁是复杂的化合物组合,含有许多氨基酸,有机酸,核酸,各种维生素,糖和糖醇,植物激素(生长素、细胞分裂素)[29],它的加入促使党参愈伤组织增多且提高不定芽分化效率,天然椰子汁可能与植物离体器官或组织拥有更高的亲和性。在康乃馨(Dianthus caryophyllus L.)和金耳石豆兰(Bulbophyllum auricomum Lindl.)中,椰子汁能明显促进愈伤组织和芽的增长[2730]
生长素被普遍作为植物生根剂,尤其是NAA、IAA和IBA普遍用于植物体外生根[31-32]。本研究中,党参再生芽在NAA和IAA的任何浓度甚至2种激素的组合中生根率都极低,部分植株在伤口处还形成愈伤组织。然而,NAA、IBA和IAA在党参体外再生的有关报道中,IAA能有效地诱导党参试管苗生根[13-14],这与本研究结果不符。同时,愈伤组织的出现会极大影响生根苗的土壤移栽,组培瓶内含有生长素的固体基质并不适合党参的生根,相反土壤中拥有多种有益物质和较好的透气性可能是党参生根的关键。瓶外生根将生根和驯化实验结合缩短了育苗周期,避免幼苗被转移到土壤中时的机械破坏。瓶外生根在组织培养早期也有所应用,在蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)、蓬蘽(Rubus hirsutus Thunb.)和蓝莓(Vaccinium corymbosum L.)中都通过对再生芽进行瓶外生根而成功建立了再生体系[33-35]。这种生根模式是组织培养技术与扦插技术的结合,再生芽基部的组织经脱分化转变为分生组织并不断分裂形成根原基。不定根原基的来源分为潜伏根原基和诱生根原基(扦插过程中,在切伤和一定环境条件下诱导而形成的根原基),潜伏根原基是插条扦插前就存在的休眠根原基,而诱生根原基由形成层、髓射线、皮层薄壁细胞、韧皮薄壁细胞、初生射线和愈伤组织产生[36]。党参茎上并未出现不定根且新生不定根都在伤口处(图3,F),因此党参不定根来自于诱生根原基。诱生根原基的形成受多种因素影响,如根原基产生位点、插穗自身组织结构(如周皮厚抑制生根)、内源激素等[37]。本研究插条为幼嫩不定芽(2~3 cm),内部生长素水平相对较高,同时扦插时又用IAA对不定芽进行了浸泡,因此生根较为容易,生根率也远远高于瓶内。党参瓶外扦插生根的生根率不算很高,但驯化基数大,并不影响整个再生体系的高效性。与传统的扦插繁殖相比,由试管苗微扦插长成的幼苗成活率高,生长量大,分枝数多,党参的瓶外生根体系可为其他生根、移栽顽拗性品种提供借鉴。
4 结论
(1)在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培养基中,茎段愈伤组织诱导率可达98.76%,而茎尖只有76.56%,茎段比茎尖更适合诱导愈伤组织。
(2)天然附加产物椰子汁对党参愈伤组织的再分化具有显著影响,在MS+60 mL/L椰子汁+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA培养基中增殖系数可达43.39,且生长过程中还会出现腋芽和基茎丛生芽。
(3)党参再生芽在培养基中生根效果不佳,但在瓶外扦插生根能够使生根率高达87.96%,移栽后植株生长茂盛,存活率为97.73%。
1无菌体系的建立
Fig.1Establishment of the aseptic system
2愈伤组织诱导及增殖实验结果
Fig.2The results of callus induction and proliferation experiment
3生根实验结果
Fig.3Rooting experiment results
1L16(45)正交增殖实验设计
Table1L16 (45) orthogonal design for the proliferation assay
2茎尖和茎段愈伤组织诱导实验结果
Table2Experimental results of callus induction from the stem tips and segments
3L16(45)正交增殖实验结果
Table3The L16 (45) orthogonal result of proliferation coefficient
4增殖系数的均值和区间结果
Table4Results of mean and range in proliferation coefficient
5增殖系数的方差分析结果
Table5Variance analysis of proliferation coefficient
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