摘要
【目的】 通过克隆笃斯越橘E3泛素连接酶基因VuARI2及分析其在拟南芥中异源表达，探索笃斯越橘VuARI2基因在低温胁迫响应中的功能。【方法】以笃斯越橘为材料，用RT-PCR和RACE技术从茎中克隆获得VuARI2基因，并对其进行系统生物信息学分析；用qRT-PCR技术分析该基因在不同组织中及低温胁迫处理下的表达模式；在拟南芥中异源表达VuARI2并对其进行冷驯化后表达水平、生理指标及冰冻处理后的抗寒性分析。【结果】VuARI2基因编码区长1770 bp，编码589个氨基酸。泛素连接酶VuARI2与野山茶、咖啡树、葡萄和河岸葡萄ARI2蛋白的氨基酸序列同源关系较近。qRT-PCR结果显示，VuARI2基因表达具有组织特异性，在叶和花芽中VuARI2的表达量显著高于根和茎中；茎和花芽VuARI2表达受低温诱导较显著。转基因植物的VuARI2基因表达量在冷驯化后显著高于野生型；总叶绿素含量降幅显著低于野生型；脯氨酸和可溶性糖含量显著高于野生型；超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性均显著高于野生型，而相对电导率和丙二醛含量显著低于野生型。冷驯化后转基因植物在冰冻低温下存活率显著高于野生型，相对电导率显著低于野生型，提高了植物抗寒性。【结论】克隆获得了笃斯越橘VuARI2基因，过表达VuARI2基因可以提高植物抗寒性。
Abstract
[Objective] This study aims to explore the function of VuARI2 gene in response to low temperature stress, by cloning and expressing VuARI2 gene in Arabidopsis. [Methods] VuARI2 gene was cloned from the stem of bog bilberry by RACE and RT-PCR and conducted a comprehensive bioinformatics analysis. Expression of VuARI2 in different tissues after cold acclimation was analyzed by RT-qPCR. Furthermore, the transgenic Arabidopsis was analyzed for the expression of VuARI2, physiological indexes, and freezing resistance. [Results] VuARI2 was successfully cloned,with an open reading frame of 1770 bp, encoding 589 amino acids. The multi-sequence alignment and phylogenetic tree analysis of VuARI2 amino acids indicated that ubiquitin ligase VuARI2 was closely related to the amino acid sequence of ARI2 proteins in wild camellia, coffee tree, grape, and riverside grape. RT-qPCR showed that the expression of VuARI2 in leaves and flower buds of bog bilberry was higher than that in roots and stems, and the expression of VuARI2 in stems and flower buds was induced under low temperature. After cold acclimation, expression levels of VuARI2 gene in transgenic plants were higher in wild type, and chlorophyll content was lower than the wild type. Proline content and soluble sugar content were higher than the wild type. Superoxide dismutase activity, peroxidase activity, and catalase activity were higher than the wild type, while relative conductivity and malondialdehyde content were lower than the wild type. After cold acclimation, the survival rate of transgenic plants was higher than the wild type，and the relative conductivity was lower than the wild type at freezing temperature，enhancing freezing resistance of plants. [Conclusions] VuARI2 gene is cloned from bog bilberry and expressed in Arabidopsis. Overexpress of VuARI2 gene enhances the cold resistance of plants.
蓝莓是杜鹃花科越橘属浆果类灌木，其果实内含有较高含量的花青素等黄酮类化合物。花青素具有较强的抗氧化能力，能够提高视力，抗衰老，降低各种癌症、心血管和泌尿系统疾病的风险[1]。因此蓝莓在世界范围内受到广泛重视[2]。截至2021年中国蓝莓栽培面积达到6.90×104 hm2，总产量达到4.771×105 t，成为蓝莓生产第一大国[3]。但蓝莓在中国北方寒冷地区栽培时经常发生冬季冻害、晚秋及早春霜冻害和生理干旱伤害，造成减产甚至绝收等，极大限制了蓝莓产业的长远发展[4]。因此开展蓝莓抗寒分子调控机制研究，挖掘抗寒相关基因，开发抗寒蓝莓品种，已成蓝莓育种工作中迫切而重要的任务[5]。
植物经过长期进化形成了复杂的冷驯化机制以抵抗低温胁迫。冷驯化过程合成了许多保护物质，如可溶性糖、脯氨酸、不饱和脂肪酸、抗氧化酶和抗冻相关蛋白[6]。这些物质参与了低温胁迫下植物渗透势调节、抑制冰晶形成、维持细胞膜稳定性和活性氧清除[5]，从而提高植物抗冻性。植物抗冻反应非常复杂，在转录、转录后、翻译和翻译后水平都受到严格调控[7]。泛素化修饰是一种蛋白质翻译后修饰，参与蛋白酶体降解、细胞周期进展、转录调控、DNA修复和信号转导等细胞过程。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）包括泛素、泛素激活酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzymes，E2）、泛素连接酶（ubiquitin ligases，E3）以及完整的26S蛋白酶体。其中E3泛素连接酶决定蛋白质泛素化的特异性，它以时间和空间调节的方式特异性地识别和结合靶蛋白，不仅有助于细胞蛋白质组的可塑性，而且还能调节植物对低温等环境信号的反应[8]。已有的研究表明ICE1、MBY 和HY5 等转录因子通过泛素化修饰调控植物低温胁迫反应[9-11]。此外，E3介导的脱落酸、茉莉酸和乙烯等激素信号途径在调控植物低温胁迫反应中也具有重要作用[12-14]。
RBR类型E3泛素连接酶最近几年才被认可单独分类，它由2个RING结构域（RING1和RING2）以及中间的IBR（in-between-RING）结构域组成[15]。根据保守的RBR结构域序列，RBRs可分为15个亚家族，其中动物有11个亚家族，植物只有4个亚家族（Ariadne、ARA54、Helicase和Plant Ⅱ）[16]。RBR型E3泛素连接酶参与细胞活动各个方面，是特殊的E3泛素连接酶家族。ARIADNE（ARI）蛋白是RBRs的1个亚类，已在果蝇（Drosophila melanogaster）[17]、小鼠（Mus muscculus）[18]、人（Homo sapiens）[19]、拟南芥（A. thaliana）[20]中得到鉴定。Ariadne亚家族的特征是具有N端C3HC4型RING结构域、BRcat结构域、Rcat结构域和C端Ariadne结构域[21]。研究表明拟南芥ARI12基因参与了拟南芥UV-B诱导和应答[22]；大豆（Glycine max）GmARI1蛋白具有E3泛素连接酶活性，其过表达显著增强了转基因拟南芥对铝胁迫的耐受性[23]。这些研究证明植物ARI基因参与了非生物胁迫抗性反应。
笃斯越橘（Vaccinium uliginosum）是杜鹃花科越橘属多年生落叶灌木，主要分布在中国东北地区、朝鲜等国家和地区，其果实中含有丰富的花青素和黄酮醇，其含量均高于部分常见的蓝莓品种，因此抗氧化活性较强，而且它还能忍耐（-50）~（-40）℃的低温[24]。前期一些参与笃斯越橘抗冻反应的基因得到了克隆和功能验证[25]，但笃斯越橘ARI基因的相关研究鲜见报道。本研究团队前期通过蛋白质组学研究鉴定出预测的E3泛素连接酶ARI2在冷驯化后丰度明显提高，推测其可能参与了笃斯越橘抗寒反应[26]。因此，以笃斯越橘茎为材料，用RACE技术克隆了E3泛素连接酶基因VuARI2，并对其进行生物信息学分析；通过农杆菌介导法获得转VuARI2的拟南芥，并对其抗寒功能进行初步分析，以期为培育蓝莓抗寒新品种提供候选基因。
1 材料和方法
1.1 试验材料
笃斯越橘苗由大连森茂现代农业有限公司提供，为4年生的扦插苗，平均苗高为37 cm。选取生长良好且整齐一致的9株笃斯越橘苗，栽植在营养钵（高16 cm，上口径16 cm，栽培基质为草炭土）中。将苗木置于人工气候箱（PQX-1000 C，宁波东南仪器制造厂）中，处理温度23℃，光照强度180 μmol/（m2·s），昼/夜光周期14 h/10 h，空气湿度65%~75%。所取样品经液氮迅速冷冻后，于-80℃超低温冰箱中保存，用于后续实验。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA 提取及VuARI2基因克隆
ORF保守核心序列克隆：用前期实验获得的笃斯越橘ARI2氨基酸序列，通过数据库检索得到近缘物种常绿越桔（Vaccinium darrowii）基因序列，分析后确定同源保守区，用Primer Premier 5.0软件设计简并引物ARI2-ZF/ARI2-ZR（表1）。取笃斯越橘茎0.5 g，用液氮研磨后，用Trizol法提取总RNA，并用HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒（Vazyme公司）反转录后得到第1条链cDNA，并以此为模板进行PCR扩增。扩增产物经电泳获得与预测大小（360 bp）接近的特异性条带，切胶回收后以F端引物测序。
RACE克隆：在ORF保守核心序列基础上利用Primer 5.0软件设计根据确认的ORF序列，分别设计目的基因的5′RACE和3′RACE巢式PCR引物。3′RACE引物为ARI2-3GSP1-F、ARI2-3GSP2-F、3′ RACE-R1和3′RACE-R2（表1），5′RACE引物为ARI2-5GSP1-F、ARI2-5GSP2-F、5′RACE-R1和5′RACE-R2（表1）。
用TAKARA公司3′Full Race Core Set with Prime Script RTase进行3′RACE，首先按照说明书利用Kit组分对样品RNA进行反转录，产物用PCR扩增，PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳并回收目的条带，连接TA/Blunt-Zero Cloning Kit克隆载体（诺唯赞公司），转化大肠杆菌并挑选阳性克隆进行测序。用TAKARA公司SMARTer RACE 5′/3′Kit进行5′RACE，按照说明书利用Kit组分对RNA进行反转录，产物用PCR扩增，PCR产物电泳后获得特异性单一条带。将该条带切胶回收，测序。
VuARI2基因全长克隆：将获得的5′RACE、3′RACE序列及已验证的核心序列用DNAMAN软件拼接，获得预测ARI2基因的全长ORF参考序列。
1.2.2 VuARI2生物信息学分析
用NCBI（national center for bio-technology information）中Blast对笃斯越橘ARI2基因的cDNA序列进行分析；根据NCBI网站的ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找开放阅读框（open reading frame，ORF）。用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam）在线工具分析氨基酸序列的理化性质；用PRABI（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_Automat.pl?page=/NPSA/npsaSopma.html）预测二级结构。用NCBI的保守域数据库（CDD）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行保守结构域预测。用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）进行三级结构分析。用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测跨膜结构域；用SignalP4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）预测信号肽；用ProtScale程序（http://web.expasy.org/protscale/）绘制蛋白质的亲、疏水性系列谱；用Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）预测亚细胞定位；用DNAMAN软件进行同源氨基酸序列比对；借助MEGA11.0软件中相邻连接方法（neighbor jointing，NJ）构建其系统进化树。
1.2.3 笃斯越橘冷驯化处理
选取生长良好且整齐一致的9株笃斯越橘苗置于低温短日照（4℃，10 h/14 h）的人工气候室中，光照强度为180 μmol/（m2·s），空气湿度为65%~75%。处理期间适时浇水，使栽培基质保持湿润。处理21 d 后，每3株混合取茎（不带花芽及叶片的1年生枝条）和花芽作为1次重复，共3次重复。所取样品经液氮迅速冷冻后，于-80℃超低温冰箱中保存。
表1PCR引物
Table1Primers used in this study
1.2.4 VuARI2序列扩增和载体构建
根据1.2.1节RACE扩增获得的目的基因拼接ORF序列，设计引物为CZ-ARI2-KpnI-F和CZ-ARI2-KpnI-R（表1）。以笃斯越橘cDNA为模板，扩增获得PCR产物。用KpnⅠ酶切载体pCambia2301-JC线性化，酶切产物纯化后与PCR产物进行重组反应，重组产物转化大肠杆菌DH5α细胞并涂布于含卡那霉素的培养基过夜培养，挑取单克隆并摇菌。通过菌液PCR筛选阳性克隆，检测引物为35S-F和2301-F（表1）。挑取PCR阳性克隆进行测序验证。测序引物为35S-F和ZT-CexuR（表1）。
1.2.5 拟南芥的转化和筛选
用CaCl2冻融法将1.2.4节得到的正确重组质粒导入根癌农杆菌UV3101感受态细胞中，挑取阳性农杆菌转化子，进行菌体PCR鉴定，引物为目的基因扩增引物。转基因材料使用哥伦比亚生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana ecotype Columbia），由本实验室提供。采用浸花法侵染拟南芥花序。植物在22℃，湿度约70%，16 h光照条件下养护至收种，农杆菌侵染当代的植株为T0代。将收获的T0代种子放入1.5 mL离心管中，用75%乙醇消毒5 min后于超净台内用无菌水清洗2~3遍，用0.1%的琼脂溶液悬浮后，均匀平铺在含卡那霉素（30 mg/L）的1/2 MS培养平板上，置于4°冰箱春化24 h后，转移至人工气候室，在温度为23℃、光照强度为10 400 lx条件下培养10 d左右。用常规PCR筛选出抗性植株，所用引物为35S-F和ARI2-R（表1）。经过连续3代的筛选，在获得的T3家系中选择2个表达量高的家系进行后续研究，命名为OE1和OE2。
1.2.6 笃斯越橘VuARI2基因表达水平分析
取23℃下生长21 d笃斯越橘根、茎、叶和花芽，以及23℃和4℃冷驯化21 d后的茎和花芽，采用天根的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）分别提取植物样品总RNA，用反转录试剂Hiscript® Ⅱ Q RT Super Mix for qPCR（+gDNA Wiper）（Vazyme # R223-01）反转录合成cDNA第1链。以此为模板进行RT-qPCR分析。以蓝莓（Vaccinium spp.）甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）作为内参基因，设计VuARI2基因特异引物ARI2-Fq和ARI2-Rq（表1），内参基因特异引物VcGapdh-Fq和VcGapdh-Rq（表1），以对照和低温胁迫下茎和花芽cDNA为模板进行PCR 反应。反应体系：TAceQ®qPCR SYBR®Green Master Mix为5 μL，正、反引物均为0.2 μL，cDNA 1 μL，加ddH2O至10 μL。扩增的反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性10 s；58℃退火30 s，40个循环，95℃ 15 s， 60℃，1 min，95℃ 15 s；40℃ 5 min样品重复3次。通过法计算内参基因的相对表达量。
1.2.7 转基因拟南芥的冷驯化处理和生理指标测定及抗寒性评价
转基因拟南芥冷驯化及生理指标测定方法：将野生型拟南芥和筛选出的OE1和OE2家系种子经过消毒和春化处理，播种到1/2 MS培养基上，15 d后将幼苗转移到基质中进行培养。基质中生长35 d后将幼苗转移到4℃、光照强度为7 320 lx的人工气候室进行冷驯化，以生长在23℃、光照强度为10 400 lx人工气候室中的幼苗为对照。在冷驯化14 d后测定叶片各项生理指标，每个指标进行3次生物学重复。用上述RT-qPCR法分析在野生型和转VuARI2拟南芥OE1和OE2家系植株叶片中VuARI2相对表达量。参考高俊凤[27]的方法，用磺基水杨酸-酸性茚三酮法测定游离脯氨酸含量（Pro）；用蒽酮比色法测定可溶性糖（SS）含量；用硫代巴比妥酸（TBA）反应测定丙二醛含量（MDA）；分别用氮蓝四唑光化还原法、愈创木酚法和紫外吸收法测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性；用分光光度法测定叶绿素（Chl）含量。用任海波等描述的方法测定相对电导率（REC）[28]。用Excel工作表和SPSS 22.0进行数据整理分析。
转基因拟南芥抗寒性评价：选取4℃冷驯化和未冷驯化（23℃）的拟南芥各45株（3次生物学重复，每次重复15株）放置在0℃冷冻人工气候箱中保持1 h，然后每1 h降低2℃，达到-20℃后保持1 h，随后将苗木转移至4℃，黑暗保存12 h，再将苗木转移到正常条件23℃、16 h光/8 h暗条件下培养5 d。通过计算冰冻处理再恢复后仍然生出新叶的幼苗数量确定存活率，最后测定这些幼苗叶片的相对电导率。
2 结果与分析
2.1 VuARI2基因克隆及表达载体构建
通过ORF保守区间序列扩增以及3′RACE和5′RACE的2轮PCR扩增获得1个ARI2基因，在DNAMAN上进行比对拼接，获得基因全长，命名为VuARI2。根据拼接得到的序列设计特异性引物，将PCR产物进行凝胶电泳，扩增到单一条带，且与目的条带大小相符。将PCR扩增获得的目的条带送上海英骏生物技术有限公司进行测序，拼接结果和测序结果完全吻合。VuARI2基因的cDNA全长2 308 bp，其中包括1 212 bp的5′-UTR，1个1 770 bp的ORF，1个326 bp的3′-UTR。该基因在213—215位为起始密码子ATG，下游有同框终止密码子TGA和多聚A尾结构。推导该序列编码589个氨基酸，蛋白质分子质量为67.79 kD，等电点为5.49。用KpnⅠ酶切载体pCambia2301-JC线性化，酶切产物纯化后与上述VuARI2 PCR产物进行重组反应，构建表达载体。测序了多个表达载体克隆，其中1个克隆与RACE结果参考序列只相差1个碱基，且为同义突变，表明成功构建过表达载体。
2.2 VuARI2生物信息学分析
根据NCBI的保守域数据库（CDD）在线软件分析VuARI2基因编码产物的结构域和功能位点，发现VuARI2具有4个典型的保守结构域（图1，A）。其中RING-HC RBR TRIAD1结构域位于117—170氨基酸位点，该模型对应于RING结构域，C3HC4型RING-HC对于RBR介导泛素化是必需的。BRcat RBR ANKIB1结构域位于197—261氨基酸位点，存在于含锚蛋白重复序列和IBR结构域蛋白1（ANKIB1）及类似蛋白中，该结构域采用与Rcat结构域相同的折叠方式，但缺乏催化反应的半胱氨酸残基和泛素化活性。Rcat RBR ARI1-like结构域位于273—326氨基酸位点，该模型对应ARI1样蛋白的Rcat结构域，为RBR E3连接酶活性所必需。Ariadne结构域位于329—589氨基酸位点，采用拉长的四螺旋束，由7~10匝长螺旋反平行排列组成。跨膜结构域与信号肽预测结果表明，VuARI2蛋白不包含跨膜结构域，无信号肽，为非分泌蛋白。将VuARI2蛋白质氨基酸序列提交到ProtScale网站（http:web.expasy.org/protscale/）进行亲、疏水性分析，从其蛋白质亲、疏水性序列分析（图1，B）中可看出，这个蛋白质同时具有疏水性和亲水性区域，疏水性氨基酸残基明显多于亲水性氨基酸残基，属于疏水性蛋白质，疏水指数为（-3.560）~1.933，疏水区域最高值（得分1.933）出现在第84个氨基酸残基，亲水区域的最高值（得分-3.560）出现在第331个氨基酸残基。
用在线软件SOPMA分析VuARI2蛋白结构特性（图2，A），该蛋白二级结构的α-螺旋结构由248个氨基酸构成，β-转角由25个氨基酸构成，延伸链由85个氨基酸构成，无规则卷曲由231个氨基酸构成，分别占VuARI2蛋白总量的42.11%，4.24%，14.43%和39.22%。蛋白质三级结构预测结果（图2，B）显示：VuARI2基因编码蛋白质以Swiss-Model Workspace上编号为5tte.1.A的模型作为模板，VuARI2蛋白质与模板37—497位氨基酸有较高相似性，相似性为32.57%。用Cell-PLoc 2.0预测VuARI2的亚细胞定位情况，显示该蛋白可能定位在细胞核，表明VuARI2可能在细胞核中发挥调控功能。
通过NCBI中Blast搜索比对，用DNAMAN软件对笃斯越橘泛素连接酶VuARI2与其他植物ARI2蛋白的氨基酸序列进行多重比对，发现VuARI2与野山茶（Camellia sinensis）、陆地棉（Gossypium hirsutum）、酸枣（Ziziphus jujuba var. spinosa）、扁桃（Prunus dulcis）、河岸葡萄（Vitis riparia）、葡萄（Vitis vinifera）、笋瓜（Cucurbita maxima）、甜瓜（Cucumis melo）、西葫芦亚种（Cucurbita pepo subsp. pepo）、咖啡树（Coffea arabica）和阿月浑子（Pistacia vera）等植物的ARI2同源性较高，均为80%以上，其中与野山茶同源性最高，为88.4%（图3），说明笃斯越橘VuARI2可能与上述植物ARI2高度相似，属于ARI2家族成员。用MEGA 11.0软件对VuARI2基因编码的氨基酸和GenBank收录的13种同源性较高植物的氨基酸构建系统进化树（图4），发现笃斯越橘与野山茶亲缘关系最近，其次是咖啡树、葡萄和河岸葡萄。
图1笃斯越橘VuARI2蛋白的保守结构域（A）和亲、疏水性分析（B）
Fig.1Conserved domains (A) and hydrophilic and hydrophobic analysis (B) of VuARI2 protein in Bog bilberry
图2笃斯越橘VuARI2蛋白的二级结构和三维结构预测模型
Fig.2The secondary structure and 3D structure model of VuARI2 in bog bilberry
A．二级结构；B.三维结构模型。横轴表示氨基酸位置，蓝色区域表示α-螺旋，红色区域表示β-转角，紫色区域表示无规则卷曲，绿色区域表示延伸链。
A．Secondary structure. B.3D structure model. Horizontal axis indicates amino acid position, blue part indicates α-helix, red part indicates β-turn, purple part indicates random coil, green part indicates extension chain.
图3VuARI2与其他植物ARI2氨基酸序列的多重比对
Fig.3Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of VcARI2 protein and ARI2 proteins from other species
Vu.笃斯越橘；Cs.野山茶；Gh.陆地棉；Zj.酸枣；Pd.扁桃；Vr.河岸葡萄；Vv.葡萄；Dz.榴莲； Cma.笋瓜；Cme.甜瓜；Cp.西葫芦亚种；Ql.美国白栎；Ca.咖啡树；Pv.阿月浑子。
Vu, V. uliginosum. Cs, C. sinensis. Gh, G. hirsutum. Zj, Z. jujuba var. spinosa. Pd, P. dulcis. Vr, V. riparia. Vv, V. vinifera. Dz, Durio zibethinus. Cma, C. maxima. Cme, C. melo. Cp, C. pepo subsp. pepo. Ql, Quercus lobata.Ca, C. arabica.Pv, P. vera.
图4VuARI2和不同物种ARI2的系统进化树
Fig.4Phylogenetic tree derived from the deduced amino acid sequences of VuARI2 and different species ARI2
2.3 VuARI2基因在笃斯越橘不同组织和冷驯化后地上越冬组织中表达分析
通过qRT-PCR检测分析笃斯越橘VuARI2基因在不同组织中的相对表达量。结果（图5，A）表明，在23℃生长21 d后VuARI2基因在笃斯越橘的叶片、花芽、茎和根部都有不同程度的表达，在叶部和花芽中表达量最高，明显高于根和茎部。叶部VuARI2基因的表达水平是茎的2.62倍，是根部的1.99倍。说明VuARI2在笃斯越橘表达具有组织特异性。在4℃冷驯化21 d后，茎中VuARI2的表达量是对照的1.45倍，花芽中VuARI2表达量是对照的1.61倍（图5，B）。说明冷驯化能够明显诱导VuARI2在地上越冬组织中的表达。
图5VuARI2在笃斯越橘不同组织（A）和冷驯化后地上越冬组织（B）中相对表达水平
Fig.5The relative expression levels of VuARI2 in different tissues and overwintering tissues after cold acclimation
不同小写字母表示不同组织间（A）和不同处理间（B）差异显著（P＜0.05）。
Different lowercase letters indicate that there were significant differences between different tissues (A) and different treatments (B) (P＜0.05) .
2.4 转VuARI2基因拟南芥植株的抗寒性鉴定
2.4.1 冷驯化对转基因拟南芥植株VuARI2基因表达和生理指标的影响
为了进一步验证VuARI2，笔者构建了35S启动子驱动的VcARI2超表达载体，并采用浸花法将其导入拟南芥，获得T0代拟南芥种子。对T0代种子进行消毒后点播在含卡那霉素的培养板上，待15 d左右移栽到基质中，置于光照培养箱中进行培养并进行PCR阳性鉴定。经过连续3代的筛选，获得T3代纯合的转基因拟南芥。选择在基质中生长35 d后长势相近的拟南芥野生型和转基因家系幼苗，置于4℃人工气候箱中冷驯化14 d后，测定冷驯化后VuARI2基因表达情况及生理生化指标，分析VuARI2基因对拟南芥抗寒性的影响。结果（图6）表明，在对照和4℃冷驯化14 d后，2个转基因植株VuARI2基因的表达量均显著高于野生型的表达量；4℃冷驯化14 d后2个转基因植株的表达量分别为对照的1.88倍和2.55倍，而野生型植株冷驯化VuARI2基因的表达量上调不明显，这说明冷驯化对野生型植株拟南芥中VuARI2基因的表达水平影响较小，但明显提高了转基因植株VuARI2基因的表达水平，因此推测VuARI2基因可能参与转基因植株的低温胁迫反应。
图6冷驯化后野生型和转VuARI2基因拟南芥中VuARI2的表达水平
Fig.6VuARI2 expression in wild type and transgenic Arabidopsis after cold acclimatization
WT.野生型拟南芥；OE-1，OE-2.转基因拟南芥。不同小写字母表示不同处理间差异显著（P＜0.05）。下同。
WT, wild type Arabidopsis. OE-1 and OE-2, transgenic Arabidopsis. Differene lowercase letters indicated that the were significant differences between different treatments (P＜0.05) . The same as below.
生理生化指标测定结果（图7）表明，对照（23℃）条件下转基因植株和野生型植株的相对电导率和丙二醛含量差异不大。4℃冷驯化处理14 d后，转基因植株中的相对电导率和丙二醛含量显著低于野生型植株，说明转基因拟南芥在冷驯化后受损伤程度较轻。低温胁迫能够影响植物中光合色素含量，从而影响其光化学反应。在对照条件下，野生型和转基因拟南芥的总叶绿素含量相当，经过冷驯化处理14 d后，野生型和转基因拟南芥总叶绿素含量整体呈下降趋势，但转基因拟南芥总叶绿素含量降幅显著低于野生型，这表明冷驯化降低了转基因拟南芥植株的光合系统受损程度。在对照条件下，野生型和转基因拟南芥中脯氨酸和可溶性糖含量均处于较低水平，经过冷驯化后，二者含量均呈上升趋势，但是转基因拟南芥中其含量增加幅度显著高于野生型，这表明冷驯化的转基因植株能增加植物脯氨酸和可溶性糖含量的积累，从而增强了其抗寒能力。4℃冷驯化的转基因植株中SOD、POD和CAT活性显著高于野生型植株，说明冷驯化后转基因植株抗氧化能力提高，抗寒性增强。
图7冷驯化后野生型和转VuARI2基因拟南芥生理指标
Fig.7Physiological indexes of wild type and transgenic VuARI2 Arabidopsis after cold acclimatization
2.4.2 转VuARI2基因拟南芥的抗寒性分析
选取经冷驯化14 d和未经冷驯化的拟南芥幼苗进行冰冻试验。-20℃冰冻1 h后再经过5 d的恢复后，通过计算此时仍然产生新叶的幼苗数量，确定存活率，最后测定叶片相对电导率。结果（图8，A）显示，冰冻处理前2种材料间没有差异，冰冻处理恢复后，未经冷驯化的野生型植株受损较重，表现为植株老叶片部分或全部干枯，转基因植株老叶片植株部分干枯。非冷驯化野生型和转基因植株的存活率和相对电导率之间差异均不显著（图8，B、C），而经过冷驯化的过表达VuARI2的转基因植株完全存活，野生型植株存活率为83%；转基因植株相对电导率（分别为19.9%和19.5%）与野生型（23.7%）之间差异显著，由此可见转基因植株具有较强的抗寒性。
图8转基因与野生型拟南芥幼苗抗冻性鉴定（A）及存活率（B）与相对电导率（C）分析
Fig.8Identification of freezing tolerance (A) and analysis of survival rate (B) and relative conductivity (C) in transgenic and wild type Arabidopsis seedlings
非冷驯化（NA）：将光周期为16 h光/8 h暗和温度为23℃条件下生长的幼苗直接进行冰冻处理； 冷驯化（CA）：幼苗在4℃下处理14 d后进行冰冻处理。
Non-acclimated (NA) , the seedlings were grown under a16-h-light/8-h-dark photoperiod at 23℃ and directly exposed to freezing treatment. Cold-acclimated (CA) , the seedlings were grown at 4℃ for 14 days before freezing treatment.
3 讨论
低温胁迫是影响植物生长、发育和地理分布的重要环境限制因素之一，严重时会造成植物死亡。然而，大多数温带植物都进化出适应低温的能力，在经过一段时间的非致死低温处理后获得更强抗冻性的适应过程称为冷驯化。在这个过程中，大量冷响应基因被诱导表达，指导植物合成各种保护物质以抵御和适应低温环境[29]。植物冷驯化提高抗冻性具有多种分子调控机制，其中E3泛素连接酶介导的蛋白质泛素化修饰在植物冷驯化蛋白功能调控中起重要作用[30-31]。RBR类型E3泛素连接酶最近被发现作为一组重要的蛋白质，参与细胞活动各个方面。然而，对植物RBR家族的研究很少。Ariadne（ARI）是RBRs家族的1个亚类，以往的研究证明ARI基因在植物抗非生物胁迫中的重要性[22-23，32]，但ARI类基因的抗寒功能尚不明确。本研究根据前期获得的笃斯越橘响应低温胁迫的蛋白质组数据，结合RECA技术克隆到1个VuARI2基因，并对其进行了鉴定和功能验证。根据预测的蛋白结构域分析，确定VuARI2基因编码的蛋白属于Ariadne亚家族，其特征是存在1个RBR结构域和1个卷曲螺旋区域，这种类似结构在拟南芥的ARI2中也有发现[20]。VuARI2蛋白二级和三级结构预测显示，α-螺旋和无规则卷曲占比较高，这与前人在大豆[23]上的研究结果一致。系统发育分析表明，VuARI2氨基酸序列与野山茶CsARI2亲缘关系最近，表明VuARI2可能与CsARI2具有相似的功能和作用机制。
在常温条件下，拟南芥根系、叶、茎、花和长角果中AtARI2具有相似的表达水平[20]；甘蓝型油菜（Brassica napus）大部分ARI基因在根和芽中表达[33]，而本研究中VuARI2基因在笃斯越橘叶和花芽中表达量明显高于根和茎。由此推测不同植物的ARI2基因可能有不同的组织表达模式。
基因表达模式在一定程度上能反映该基因的功能[34]。U-box型E3-泛素连接酶蛋白OsPUB2和OsPUB3是水稻低温胁迫反应的正调节因子。OsPUB2在低温条件下表达上调，在水稻植株中过表达OsPUB2具有耐寒表型，包括提高存活率、增加叶绿素含量和减少离子渗漏[35]。CaPUB1是存在于辣椒（Capsicum annuum）内的U-box型E3泛素连接酶，泛素化底物是26S蛋白酶体的1个亚基RNP6。低温（4℃）会促进CaPUB1在水稻根和叶组织中的表达，水稻植株过表达CaPUB1时，DREB1A、DREB1B、DREB1C等低温诱导基因转录水平均提高，从而使植株表现出对低温更强的耐受性[36]。本研究中，冷驯化后笃斯越橘地上越冬器官茎和花芽中VuARI2的相对表达量均明显上调，其中茎中VuARI2基因与VuARI2蛋白的表达模式[25]一致。Wahid等通过转录组研究发现甘蓝型油菜（B. napus）低温处理后AtARI13直系同源基因表达量上调2~5倍[37]。由此可以推断ARI基因可能在植物低温抗性反应中发挥重要作用。
为了进一步研究VuARI2在笃斯越橘抗冻性形成过程中的功能，获得了转VuARI2基因植株，并测定冷驯化后植株中VuARI2相对表达量和抗寒相关生理生化指标，随后进行了未冷驯化和冷驯化植株抗寒性评价。有研究表明相对电导率大小可以反映植物质膜受伤害的程度，其值越低细胞损伤程度越小。丙二醛（MDA）是高活性膜脂过氧化产物，其含量越高细胞膜受损伤越严重，植物体的耐低温胁迫能力越差，因而相对电导率和MDA含量可作为评价膜系统受损和抗寒性的指标[39]。冷驯化植株中叶绿素含量变化率越小，叶绿体结构受到的伤害越小，具有较高的光合能力和细胞膜稳定性，从而增强植物耐寒性；脯氨酸通过渗透调节作用保护原生质体和蛋白质分子；可溶性糖既可清除胁迫下的有毒ROS，还可作为渗透调节物质参与植物抗寒，保护膜结构适应低温环境；抗氧化酶SOD、POD和CAT活性水平提高，使植物抵御活性氧伤害的能力增强，从而提高植物的抗寒性，因此，冷驯化植物体内叶绿素含量、脯氨酸和可溶性糖的积累量，以及SOD、POD和CAT活性被广泛作为评价植物抗寒性的生理指标[40]。本研究结果表明，在对照条件下，转基因拟南芥中VuARI2的相对表达量明显高于野生型拟南芥，这表明VuARI2已被成功转入拟南芥中；尽管在冰冻处理再恢复后转基因拟南芥受害表型较野生型拟南芥轻，但二者质膜均已受到较为严重的伤害，存活率均为50%，说明缺乏冷驯化的转基因植株VuARI2表达量并不足以提高抗冻性。尽管冷驯化后野生型拟南芥VuARI2基因表达量没有增加，但脯氨酸、可溶性糖含量以及SOD、POD和CAT活性明显高于对照，使其低温耐受性显著增强，说明冷驯化能明显提高野生型拟南芥抗寒性，这可能与低温诱导其他抗寒相关基因表达和合成低温保护物质有关[40]。与未冷驯化相比转基因植株和冷驯化的野生型拟南芥相比，冷驯化的转基因植株VuARI2基因表达量显著增加；脯氨酸和可溶性糖含量明显提高；SOD、POD和CAT活性明显增强；此外，冷驯化转基因拟南芥植株叶绿素含量降幅明显小于野生型，冷驯化引发的这一系列生理响应，增强了膜稳定性，提供渗透保护并提高抗氧化水平，从而显著提高转基因植株冰冻处理后的存活率，显著降低了相对电导率。以上分析表明转VuARI2基因拟南芥明显提高了抗寒性，但其具体的作用机制尚不清楚，今后应需进行VuARI2基因产物的底物蛋白鉴定，明确VuARI2基因在笃斯越橘抗寒反应中的调控机制。
4 结论
（1）VuARI2基因cDNA全长2 308 bp，含1 770 bp完整开放阅读框，编码589个氨基酸。该蛋白分子质量为67.79 kD，等电点为5.49，为没有信号肽结构域和跨膜结构域的疏水性蛋白质。
（2）VuARI2蛋白由α-螺旋和不规则卷曲构成，无信号肽和跨膜结构，为疏水性蛋白。VuARI2具有Ariadne蛋白特征，其N端为典型的RBR结构域，C端含有Ariadne结构域。
（3）笃斯越橘VuARI2与野山茶同源性最高，相似性达88.4%，其次与咖啡树、葡萄和河岸葡萄同源性较高，相似性均超过80%。进化树分析结果显示笃斯越橘VuARI2与野山茶CsARI2聚为一簇。
（4）笃斯越橘VuARI2在叶和花芽中表达量较高，在根和茎中表达量较低。笃斯越橘茎和花芽中VuARI2在冷驯化后表达量均明显上调。
（5）冷驯化后转VuARI2拟南芥植株明显维持较高的总叶绿素含量；提高了渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖的含量；增强了抗氧化酶SOD、POD和CAT活性。冷驯化的转基因植株冰冻处理后生存率达到100%，显著高于野生型植株（83.3%）；2个转基因家族植株相对电导率显著低于野生型，表明冷驯化转基因拟南芥植株的抗寒能力显著提高。
