摘要
【目的】为明确鲜黄小檗叶绿体基因组结构特征及其与同属类群的系统发育关系,对鲜黄小檗叶绿体基因组的结构特征进行解析和系统发育分析。【方法】用Illumina Hiseq X Ten技术测序,用 CPGview、CodonW、MISA、 Reputer、IRscope、mVISTA 软件对鲜黄小檗叶绿体基因组特征进行分析,MEGA7软件中的 ML法构建系统发育树。【结果】鲜黄小檗叶绿体基因组全长166225bp,呈典型的四分体结构,全基因组 GC含量为38.07%;共注释得到144个基因,包括99个蛋白质编码基因、37个tRNA 基因和8个rRNA 基因,其中23个基因含有内含子,32个基因为双拷贝基因;偏好使用 A/U 结尾的密码子;共检测到98个SSR位点和150个散在重复序列,大部分SSR位点由 A和 T碱基组成;SSC和IR区的变异程度高于 LSC区;系统发育分析发现鲜黄小檗与威宁小檗亲缘关系最近。 【结论】鲜黄小檗叶绿体基因组特征与小檗属其他物种类似,为该属物种的分子鉴定、进化关系等提供了理论基础。
Abstract
[Objective] In order to examine the structural features of the chloroplast genome of Berberis diaphana and the phylogenetic relationship with the taxa of the same genus, we analyzed its chloroplast genome structure and performed phylogenetic analysis. [Methods] Sequencing was performed by Illumina Hiseq X Ten technology. The chloroplast genome characteristics of B. diaphana were analyzed by using CPGview, CodonW, MISA, Reputer, IRscope, and mVISTA. Phylogenetic tree was constructed by ML method in MEGA7 software. [Results] The chloroplast genome of B. diaphana showed a length of 166225 bp, with a typical quadripartite structure and the GC content of the whole genome was 38.07%. A total of 144 genes were annotated, including 99 protein coding genes, 37 tRNA genes, and 8 rRNA genes. Among them, 23 genes contained introns, and 32 genes were present in duplicate copies, with preference for codons ending in A/U. A total of 98 SSR loci and 150 scattered repeat sequences were detected, and most SSR loci composed of A/T bases. The degree of variation in the SSC and IR regions was higher than that in the LSC region. Phylogenetic analysis revealed that B. diaphana was most closely related to B. weiningensis. [Conclusion] The chloroplast genome structure of B. diaphana is similar to other species of berberis, providing a theoretical basis for molecular identification and evolutionary relationship of this genus.
叶绿体是高等植物进行光合作用的重要细胞器，同时还参与脂肪酸、氨基酸、激素、维生素、核苷酸和次生代谢产物的生物合成[1]。陆生植物叶绿体基因组 DNA 通常是双链环状的四分体结构，包括2 个相互倒置的重复区（inverted repeat，IR）、1个大单拷贝区（large singly copy，LSC）和1个小单拷贝区（small singly copy，SSC），其中 LSC和SSC正好被2 个IR 区分开[2]。大多数叶绿体基因组包括 110~130个基因，其主要功能涉及光合作用、转录和翻译[3]。与核基因组相比，叶绿体基因组结构稳定，基因序列高度保守，因具有单拷贝遗传、重组率低、适宜的进化速率等优点，成为物种鉴定和系统发育研究的理想材料[4-5]。
小檗属（Berberis L.）是小檗科中最大的一个属，其植物种类繁多，全世界约有500多种，广泛分布于欧洲、亚洲、非洲和美洲的温带和亚热带地区[6]。鲜黄小檗是小檗科小檗属落叶灌木，主要分布在中国陕西、甘肃、青海等地。小檗果可食用，如用于果汁和碳酸饮料[7]。相关研究表明，小檗属植物含有多种生物活性成分，如黄酮类化合物（槲皮素、杨梅素和木犀草素）[8-9]、酚类化合物（绿原酸、咖啡酸和香草酸）[10-11]、花青素[12-13]、生物碱（小檗碱和棕榈碱）[14]、单宁、碳水化合物、萜类化合物和类固醇[15-16]，其中最主要的是生物碱中的小檗碱，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血压、降血脂、抗菌等作用[17]。小檗属植物在中国药用历史悠久，是民间清热解毒的一味常用中药，但由于该属物种分布地区广泛、生境多样性等特点导致其形态学特征上的多样性，因此需要对其进行准确的区分。目前，对鲜黄小檗的研究主要集中在育苗、化学成分和药理作用等方面，而对其叶绿体基因组相关的研究鲜见详细报道。该研究采用高通量测序技术对鲜黄小檗叶绿体基因组进行测序、组装和注释，并进行序列特征、密码子偏好性、重复序列、系统进化关系以及与近缘同属植物叶绿体基因组的比较分析，以期为鲜黄小檗叶绿体基因工程、遗传多样性分析及物种鉴定等研究提供参考。
1 材料和方法
1.1 植物材料与测序
鲜黄小檗新鲜叶片采自青海省循化撒拉族自治县清水乡孟达村（102.6749°E，35.7917°N），经青海大学孙胜男副教授鉴定为小檗科小檗属鲜黄小檗，新鲜叶片采集后立即装入10 mLEP 管并在液氮中保存，标本存放于青海大学生态环境工程学院，编号为 TMSGS21003。用 CTAB法[18]提取鲜黄小檗叶片 DNA，用Illumina Hiseq X Ten技术对样品进行paired-end测序。
1.2 叶绿体基因组组装和注释
对测序得到的原始数据进行质控后使用 SPAdes对鲜黄小檗叶绿体基因组进行组装[19]。将鲜黄小檗叶绿体基因组序列上传至 GeneBank数据库，得到的登录号为 MZ962404。用 CPGview 完成鲜黄小檗叶绿体基因组图谱的可视化、编码基因的注释以及顺式和反式剪接基因的预测和可视化[20]。
1.3 密码子偏好性分析
用 CodonW version 1.4.4软件对鲜黄小檗叶绿体基因组同义密码子的相对使用度（RSCU）进行分析统计。RSCU>1 表示该密码子使用较多，RSCU<1表示该密码子使用较少，RSCU=1则无使用偏好。
1.4 重复序列分析
在线工具 MISA（https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）用于分析鲜黄小檗叶绿体基因组中的简单重复序列（simple sequence repeat，SSR），设置参数为单核苷酸重复次数≥10，二核苷酸重复次数≥5，三核苷酸重复次数≥4，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复次数≥3。用在线软件 Reputer（https://bibiserv.cebitec.unibielefeld.de/reputer）分析散在重复序列（n≥30bp）[21]，其重复类型包括4 种:正向重复、反向重复、互补重复以及回文重复。
1.5 叶绿体基因组比较分析
在线工具Irscope用于绘制IR 边界的收缩和扩张图[22]。以直穗小檗（B.dasystachya Maxim.，MZ983398）作为参照，用在线软件 mVISTA 比较鲜黄小檗和5个近缘物种叶绿体基因组的结构[23]，包括阿里山十大功劳（Mahonia oiwakensis，MN735221）、威宁小檗（B.weiningensis，MW018363）、阔叶十大功劳（M .bealei，NC_022457）、朝鲜小檗（B.koreana，NC_030063）、黄芦木（B.amurensis，NC_030062），选择Shuffle-LAGAN 模型，参数默认。
1.6 进化树分析
从 NCBI数据库中下载19个小檗科物种的叶绿体基因组序列进行系统发育分析。用 MEGA7 软件中的最大似然方法（ML）构建系统发育树，自展值设置为1000 [24]。
2 结果与分析
2.1 鲜黄小檗叶绿体基因组特征
研究中用的鲜黄小檗叶片形态特征如图1所示，对原始测序数据进行过滤后，鲜黄小檗叶绿体基因组中共有11791180个有效数据（clean pairedend reads），碱基总数为3.5G，碱基质量分数高于 Q30 的占93.05%，高于Q20 的占97.44%。
鲜黄小檗叶绿体基因组和其他已测序的被子植物叶绿体基因组类似，都具有典型的四分体环状结构，基因组全长为166225bp，其中包括73596bp 的大单拷贝区（LSC）、18721bp的小单拷贝区（SSC）和2个反向重复序列区（IRa/IRb:各36954bp）。整体 GC含量为38.07%，与 LSC和SSC（32.59%）区域相比，IR 区域的 GC 含量（41.02%）相对较高（图2）。
图1鲜黄小檗叶片形态特征
Fig.1The leaf phenotype of B. diaphana
图2鲜黄小檗叶绿体基因组图谱
Fig.2Gene map of chloroplast genome of B. diaphana
2.2 鲜黄小檗叶绿体基因组编码的基因分类
鲜黄小檗叶绿体基因组共编码144个基因，包括99个蛋白质编码基因、37个tRNA 基因和8个 rRNA 基因。其中，有32个基因在IRs中呈现双拷贝，包括7个tRNA 基因、4个rRNA 基因和21个蛋白质编码基因（表1）。
表1鲜黄小檗叶绿体基因组编码基因
Table1Genes in B. diaphana chloroplast genome
注：×2表示在IR区域双拷贝；a表示含有1个内含子；b表示含有2个内含子。
Note: ×2 indicates two gene copies in the IRs. a indicates one intron. b indicates two introns.
这144个基因根据功能可以划分为3大类，分别是转录和翻译相关基因、光合作用相关基因、其他功能基因和未知功能基因。转录和翻译相关基因共有83个，包括37个tRNA 基因、8个rRNA 基因、 18个核糖体小亚基基因、15个核糖体大亚基基因和 5个 DNA 依赖性 RNA 聚合酶基因; 光合作用相关的基因有50个，包括5个光系统I基因、20个光系统Ⅱ基因、5个细胞色素复合物编码基因、6个 ATP 合酶基因、1 个 ATP 依赖蛋白酶基因、1 个 RuBisCO 大亚基基因和12个 NADH 脱氢酶亚基基因; 其他功能基因和未知功能基因共有11个，包括6个其他功能基因和5个未知功能基因（表1）。
在鲜黄小檗叶绿体基因组中，共有23个含内含子的基因，包括8个tRNA 基因和15个蛋白质编码基因，其中有6个基因位于IRs区域并呈现双拷贝，包括2个tRNA 基因（trnA-UGC 和trnI-GAU）和4 个蛋白质编码基因（rpl16、rpl2、ndhB、rps12）。除了基因ycf3、clpP 和rps12（×2）含有2个内含子外，其他 19 个基因均含有 1 个内含子（表1）。此外，在鲜黄小檗叶绿体基因组中预测到了13个顺式剪接基因，这些基因的结构如图3，A 所示，反式剪接基因rps12 的结构如图3，B，该基因含有3个独特的外显子，其 5'端位于 LSC 区域，3'端位于IR 区域。
图3鲜黄小檗叶绿体基因组中的顺式和反式剪接基因
Fig.3Cis and trans splicing genes in the chloroplast genome of B. diaphana
A.顺式剪接基因的结构；B.反式剪接基因（rps12）的结构。图中黑色表示外显子，白色表示内含子，箭头表示基因的方向。
A. The structure of cis splicing genes. B. The structure of the trans splicing gene (rps12) . In the figure, black boxes represent exons, white boxes represent introns, and arrows indicate the direction of genes.
2.3 密码子偏好性分析
鲜黄小檗叶绿体基因组密码子偏好性结果表明，该叶绿体基因组由28308个密码子编码，其中 RSCU>1的密码子有31个，除密码子 UUG（rnLCAA）和 UCC（trnS-GGA）外，其他密码子都是以 U、A 碱基结尾，分别有16个和13个，占 RSCU>1 密码子总数的93.55%（图4，A）。此外以 U、A 碱基结尾的密码子占所有密码子总数的69.06%，说明鲜黄小檗叶绿体基因组密码子偏向以 U、A 碱基结尾。还发现鲜黄小檗叶绿体基因组中最常用的4 个密码子是 AAA（赖氨酸）、AUU（异亮氨酸）、 GAA（谷氨酸）和 UUU（苯丙氨酸），数量和占比分别为1165（4.40%）、1142（4.31%）、1097（4.14%）和 1027（3.88%）。最常用的氨基酸是亮氨酸（2888），最不常用的是半胱氨酸（325）（图4，B）。
2.4 重复序列分析
SSR是基因组中由1~6个核苷酸组成的基因多次重复的片段，不同物种中的 SSR 位点、重复单元和重复次数均存在差异。在鲜黄小檗叶绿体基因组中共发现98个SSRs，其中包括70个单核苷酸重复序列（71.43%），包括 A 和 T2种重复类型; 有10 个二核苷酸重复序列（10.20%），3个三核苷酸重复序列（3.06%），7个四核苷酸重复序列（7.14%）和8 个六核苷酸重复序列（8.16%），未发现五核苷酸重复序列（图5，A）。鲜黄小檗叶绿体基因组的 SSR 类型中单核苷酸重复序列占比最高，且都是 A 和 T 碱基，其他重复序列大部分也都由 A 和 T 组成，表明鲜黄小檗叶绿体基因组 SSR 序列更偏好 A/T 碱基。
此外，在鲜黄小檗叶绿体基因组中共检测到150 个散在重复序列（图5，B），长度范围在30~140bp 之间。其中正向重复序列88个，占总数的58.67%; 回文重复序列45个，占总数的30%; 反向重复序列 17个，占总数的11.33%; 未出现互补重复序列。长度为30~39bp的重复序列最多，有76条，占总数的50.67%。
图4鲜黄小檗叶绿体基因组密码子偏好性分析
Fig.4Codon preference analysis of the chloroplast genome of B. diaphana
A.同义密码子相对使用度（RSCU）；B.密码子使用次数。
A. Relative synonymous codon usage (RSCU) . B. Codon usage frequency.
图5鲜黄小檗叶绿体基因组重复序列分析
Fig.5Analysis of repeat sequences in the chloroplast genome of B. diaphana
A.SSR类型和数量；B.散在重复序列的类型和数量。
A. SSR types and numbers. B. Types and quantities of scattered repetitive sequences.
2.5 叶绿体基因组比较分析
为了探究鲜黄小檗叶绿体基因组IR边界在进化过程是否发生收缩和扩张，选取5个近缘物种分析 IR边界的扩张和收缩情况。结果（图6）显示，6个小檗科植物叶绿体基因组长度差异不大，为164792~166758bp，边界基因的位置和类型存在一定差异。鲜黄小檗、阿里山十大功劳和阔叶十大功劳具有相同的JLB和JLA连接位点，并且边界两侧的基因相同。 JSB和JSA连接位点均位于ycf1 基因内，但基因向两边的扩增程度不同。与其他5种小檗科植物相比，鲜黄小檗IRb区缺少trnN 基因。比较鲜黄小檗与5 个近缘物种的基因组序列差异，结果如图7所示，所有叶绿体基因组序列高度保守，基因间区域的变异位点高于基因区域的变异位点。
图6鲜黄小檗及近缘物种叶绿体基因组边界图
Fig.6Border regions of the chloroplast genome of B. diaphana and related species
图7鲜黄小檗及近缘物种叶绿体基因组结构比较
Fig.7Comparison of the chloroplast genomic structures of B. diaphana and related species
此外，在CNS区发现一些高度变异区，例如trnHGUG-psbA，matK-rps16，ndhC-trnV-UAC，rpl23-ycf2。accD 和ycf1 基因的外显子区的序列在 6 个小檗科叶绿体基因组中具有显著变异。
2.6 系统进化分析
选取小檗科内包括鲜黄小檗在内共20种植物构建系统发育树。结果（图8）表明，鲜黄小檗和威宁小檗以 100% 支持率聚为一类，两者亲缘关系最近。
系统发育树被分为两大支，其中小檗属和十大功劳属的植物聚在同一支上，其余7个属的植物则聚在另一支上。
图8基于叶绿体全基因组构建的系统发育树
Fig.8Phylogenetic tree based on complete chloroplast genomes
3 讨论
本研究基于高通量测序技术和生物信息学分析方法完成了鲜黄小檗叶绿体基因组的测序、组装与注释，并进行了较为全面的分析。结果显示，鲜黄小檗叶绿体基因组全长166225bp，具有典型的四分体结构，注释得到 144 个功能基因，总 GC 含量为 38.07%，这些结果与小檗属其他物种叶绿体基因组结构特征基本相似，李述成等研究表明，9个小檗属植物的叶绿体基因组范围为164774~166758bp，且都是典型的四分体结构，这9个小檗属植物叶绿体基因组 GC含量均为38%，功能基因总数范围为 95~104，说明小檗属内各个种的叶绿体基因组在序列长度、基因组成以及 GC 含量等方面相对保守[25]。其中IR区域的 GC 含量明显高于其他区域（LSC、SSC），这与IR 区rRNA 基因的高 GC 含量有关，这种现象在其他开花植物中也非常常见[26-27]。rps12 基因是所有叶绿体基因中比较特殊的一个，含有3个外显子，经反式剪接作用编码核糖体小亚基S12蛋白，该基因由5'-rps12（仅包含外显子1）和3'-rps12（包含外显子2、内含子和外显子3）两部分组成，通常 5'-rps12 位于 LSC 区，3'-rps12 位于IR 区，其定位会随着IR 区的扩张和收缩进入或离开IR区[28]。鲜黄小檗叶绿体rps12 基因5'端位于LSC区域，3'端位于IR区域，推断rps12 基因进化保守，这一结果在其他被子植物中也有体现[26]。
密码子偏好性是生物体基因组进化的重要特征，而 RSCU 值则是评估密码子偏好程度的重要参数。本研究结果表明，鲜黄小檗叶绿体基因组中共有64种密码子，偏好密码子有31种，且偏好使用 A、U 碱基，这一结果与桃儿七、直穗小檗和淫羊藿属58种植物叶绿体基因组密码子的使用偏好性结果[29-31]一致，同时也验证了物种种间越亲近，密码子使用模式越相似这一理论[32]。
SSR标记具有共显性遗传、多态性、重复性好、操作简易等优点，被广泛应用于分子遗传育种、种群遗传多样性分析、进化过程、近缘物种鉴定等领域[33]。在鲜黄小檗叶绿体基因组中共检测到98个 SSR位点，其中单核苷酸重复序列数量最多（70 个），占比最高（71.43%），且SSR 位点偏向使用 A/ T碱基，与小檗科内其他植物序列特征相似，这一结果进一步验证了叶绿体 SSR 通常由多腺嘌呤（polyA）和多胸腺嘧啶（polyT）重复组成，很少包含 C或 G 串联重复的观点[29-30，34]。鲜黄小檗叶绿体基因组中散在重复序列包括正向重复、反向重复和回文重复3种类型，但在小檗科内其他植物如桃儿七、科尔切斯淫羊藿叶绿体基因组中只有正向重复和回文重复2种类型[30，35]，未出现反向重复序列，散在重复序列的这种差异还需要更多数据的验证。以上结果可为后续进一步研究鲜黄小檗的分子标记、作物育种以及群体遗传分析提供参考。
叶绿体基因组中IR边界的扩张和收缩是植物进化过程中常见的一种现象，大多数光合植物叶绿体基因组IR区长度变化为5~76kb，在植物的进化过程中可能会经历多次的缩减和扩增，因此IR区的扩张、缩小或丢失是造成叶绿体基因组长度差异和结构变异的主要原因，也是区分特定类群的重要特征之一[36]。有研究表明小檗科中的小檗属和十大功劳属的质体基因组中存在1个典型的特征———IR区大型扩张（约10kb）[37]，鲜黄小檗IR区长度为36954bp，与小檗属和十大功劳属植物IR区长度接近，在长期的进化过程中小檗属和十大功劳属植物的IR区没有缩减和消失，说明IR区可能是其生长发育所必须的，也在维持叶绿体基因组的稳定性中起到重要作用。鲜黄小檗与其近缘物种的叶绿体基因组 LSC、SSC和 IR区的大小和边界基因存在一定差异，且 SSC 和 IRa/IRb区的差异大于LSC区，推测这种现象可能是由于物种的分布区域和长期进化过程造成的。该研究中，鲜黄小檗和近缘种主要在JSB边界和JSA边界存在差异，这2个边界包括ycf1 基因横跨和无基因横跨2种类型。叶绿体基因组中的多种基因、内含子和基因间隔区为不同分类阶元的系统发育重建过程提供了便利，如在比较3种大黄的叶绿体基因组序列后发现三者间存在8个高变异区域可用作大黄药材鉴别的超级 DNA 条形码[38]。本研究的叶绿体基因组序列比对结果显示，鲜黄小檗与其近缘物种的叶绿体基因组高度相似，编码区相对于非编码区更保守，但在trnH-GUG-psbA、matK-rps16、ndhCtrnV-UAC、rpl23-ycf2 等的基因间隔区，以及accD 和ycf1 基因的外显子区的序列存在不同程度的变异现象，有望从这些区域中开发用于小檗属植物种间鉴定和系统发育的分子标记。研究表明，在小檗科内十大功劳属与小檗属是2个核心属，亲缘关系最近，为姊妹群，和小檗科内其他类群明显区分开[6]，这与本研究的系统发育树结果一致。
4 结论
鲜黄小檗叶绿体基因组全长166225bp，呈现典型的四分体结构，全基因组 GC 含量为38.07%; 共注释得到144个基因，包括99个蛋白质编码基因、37个tRNA 基因和8个rRNA 基因; 偏好使用 A/U 结尾的密码子; 共检测到 98 个 SSR 位点和 150个散在重复序列，SSR 位点以单核苷酸重复序列为主; IR 区的大小与小檗属和十大功劳属植物相似，SSC和IR区的变异程度高于 LSC区; 鲜黄小檗与威宁小檗亲缘关系最近。
