花花柴热形态发生基因KcPIF4克隆及耐热性分析
doi: 10.7606/j.issn.1000-4025.20240227
黄婉夷1 , 李文龙1 , 王彦芹1,2
1. 塔里木大学 生命科学与技术学院,新疆阿拉尔 843300
2. 塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室,新疆阿拉尔 843300
基金项目: 新疆生产建设兵团财政科技计划项目“南疆抗逆棉花品种创新利用及示范推广”(2022DB012) ; 农业农村部重点项目“耐逆丰产分子设计育种体系构建”(2023ZD04040-4-2) ; 塔里木大学研究生科研创新项目“花花柴热响应路径关键基因的克隆及耐热性分析”(TDGRI202208)
Cloning and heat tolerance analysis of the thermomorphogenesis gene KcPIF4 in Karelinia caspica
HUANG Wanyi1 , LI Wenlong1 , WANG Yanqin1,2
1. College of Life Science and Technology, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300 , China
2. Xinjiang Production & Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Alar, Xinjiang 843300 , China
摘要
目的】荒漠植物花花柴具有极强的耐高温性,克隆并研究其耐高温基因,将其用到棉花等经济作物上以期提高其耐热性,为作物耐高温性分子育种提供理论基础和基因资源。【方法】克隆花花柴 KcPIF4 基因并进行生物信息学分析;烟草瞬时表达分析其蛋白亚细胞定位;用qRT-PCR分析45 ℃处理5,30,120,240min时 KcPIF4 在花花柴幼苗根、茎和叶中的表达量;观察45 ℃处理下过表达 KcPIF4 拟南芥表型变化并测定相关生理生化指标。【结果】花花柴 KcPIF4CDS全长为1593bp,编码530个氨基酸,含1个bHLH 保守结构域,基序与多种植物的同源蛋白间存在差异;其蛋白定位在叶片气孔保卫细胞膜上;KcPIF4 在花花柴叶中表达量随处理时间延长先上调再下调随后又上调,240min时达最高,为对照组的4.4倍;过表达 KcPIF4 拟南芥叶片45℃下黄化萎蔫程度低于野生型,其 CAT、SOD、POD、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素显著高于野生型,MDA 含量和相对电导率显著低于野生型。【结论】花花柴 KcPIF4 对高温胁迫表现出耐受—响应—适应的变化,能增强拟南芥对高温的耐受能力,表明该蛋白具有耐高温性。
Abstract
[Objective] The desert plant Karelinia caspica has strong heat tolerance. The aim is to clone and study the heat-tolerant genes of K. caspica, and apply them to economic crops such as cotton to enhance heat resistance. This provides a theoretical basis and genetic resources for molecular breeding of heat-tolerant crops. [Methods] KcPIF4 gene was cloned and bioinformatics analysis was performed. Subcellular localization of the protein was analyzed through transient expression in tobacco. qRT-PCR was used to analyze the expression of KcPIF4 in roots, stems, and leaves of K. caspica seedlings at different time under 45 ℃ treatment. Changes in phenotype of Arabidopsis overexpressing KcPIF4 at 45 ℃ were observed, and relevant physiological and biochemical indicators were measured. [Results] The full length CDS of KcPIF4 is 1593 bp, encoding 530 amino acids and containing a bHLH conserved domain. The motifs showed differences compared to homologous proteins from various plants. The protein was localized at the membrane of the guard cell of stomata. qRT-PCR showed that the expression of KcPIF4 in K. caspica leaves was first increased and then decreased, and increased again with prolonged treatment time, reaching its peak at 240 min, 4.4 times higher than the control. Overexpression of KcPIF4 in Arabidopsis produced less chlorosis and wilting in the leaves compared to the wild type at 45 ℃, with higher level of CAT, SOD, POD, chlorophyll a, chlorophyll b, and carotenoids, as well as lower level of MDA content and relative conductivity compared to the wild type. [Conclusion] KcPIF4 functions in tolerance-response-adaptation to high temperature stress, enhancing Arabidopsis tolerance to high temperature. This result suggests that the protein has high temperature resistance.
气候变化加剧了极端高温事件的发生,生物所面临的各种由高温引起的危害增加。高温会影响植物的生长甚至会造成植物死亡,而在长期的高温胁迫下,植物会通过调控基因表达来适应环境[1]。短期急剧高温会使植物叶片、幼茎晒伤甚至烧焦,抑制枝条和根系生长[2]。因此,研究植物对高温的响应能力,挖掘耐高温相关基因,研究其耐高温分子机理,对阐释植物耐高温生物学、发掘利用耐高温植物种质资源及基因资源具有重要意义。
热形态发生是指植物对环境温度升高做出的形态变化反应,植物通过增加器官的伸长生长帮助植物适应高温胁迫,以提高叶片的冷却能力[3]。在陆地真双子叶植物中,下胚轴和叶柄的伸长是幼苗中最显著的热形态反应之一,随温度升高,气孔和表皮细胞之间的比率也会随之升高,主根变得更窄更长,因此持续的高温也会降低气孔指数[4-5]。研究发现,热形态发生的核心通路是由光敏色素互作因子(phytochrome interacting factor 4,PIF4)和其他调节植物生长和发育以响应温度和不同光照条件的因子主导[6]。有多项研究表明,拟南芥中的 PIF4 直接与染色质重塑因子、转录因子和组蛋白膜乙酰酶等多种蛋白质相互作用,在转录水平调节多种靶点来控制避光、叶片衰老、下胚轴生长、热形态发生、重力反应、花青素积累和开花时间[7-8]。高温诱导的变化适应是通过 PIF4介导,当温度升高的瞬时,PIF4 表达水平提高[9]
花花柴(Karelinia caspica,简称 Kc)是菊科花花柴属的1种多年生草本植物,主要分布于荒漠地区,内部有发达的储水组织,具有极强的保水能力以及耐盐、耐旱和耐高温等耐逆特性。本课题组在前期对花花柴的耐高温性进行了探测,发现其可以长时间耐受40℃的高温,对45℃的持续耐受时间约为8h; 对50℃的耐受时间约为1h [10-11]。此前已从花花柴中克隆的耐高温相关基因 HTR,发现原核表达后能增强细菌耐高温能力[12]。同时,花花柴在受到高温胁迫时,其光系统Ⅱ(PSⅡ)也会受到影响。陈凤丽等[13]发现当温度超过52℃后,花花柴的 PSⅡ反应中心才会发生永久失活且不可逆。
目前,关于PIF4 在除拟南芥以外的植物中研究甚少,且研究方向主要包括PIF4 基因的耐盐、耐旱以及对开花的影响等,在耐高温方面涉及不多。在拟南芥中,PIF4 参与其热形态的建成,与高温下免疫抑制直接相关,能适应高温[14]。结合花花柴生境,推测其与植物热形态发生相关基因在理论上可能具有更强的耐高温能力,那么关于花花柴 PIF4 基因表达的蛋白质功能、保守基序与拟南芥或者其他如棉花等经济作物的同源基因有什么区别? 耐高温能力又是否更强? 因此通过克隆花花柴 KcPIF4 基因,研究其蛋白质定位情况,分析其可能存在的功能,同时对 KcPIF4 耐高温性进行验证,明确其耐高温功能,为阐述 KcPIF4 基因的耐高温性功能研究提供理论依据,同时为转基因棉花等经济作物的耐高温性生物技术育种提供理论基础和基因资源。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料
试验所用花花柴种子于2021年9月在阿拉尔市荒漠地带采摘并经过自然干燥后保存。野生花花柴来源于塔里木盆地阿拉尔市塔里木大学; 试验所用烟草为本氏烟草; 试验所用拟南芥为哥伦比亚野生型拟南芥。
1.1.2 菌株与载体
克隆载体 pMD19-T 购自北京宝日医生物技术; 亚细胞所用表达载体pCAMBIA1302来自实验室保存; 植物表达所用载体pDONR221及pK2GW7 由华中农业大学惠赠; 大肠杆菌 DH5α 感受态、农杆菌 GV3101 感受态均购自上海唯地生物有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 花花柴KcPIF4 基因克隆
用天根 RNAprep Pure Plant Kit试剂盒提取花花柴总 RNA,同时用全氏金一步法反转录试剂盒反转录得到cDNA,整个试验均参照试剂使用说明书。设计并合成特异性引物KcPIF4 F和KcPIF4 R(表1),用反转录得到的cDNA 进行PCR扩增,扩增体系:95℃预变性4min; 95℃变性30s,59℃退火30s,72℃ 延伸 90s,35 个循环; 72℃ 延伸 7 min; 4℃ 冷却 15 min。用 1.0% 琼脂糖凝胶电泳 100V,25min进行检测,跑出的 DNA 条带用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒增强型进行回收,并与 pMD19-T 载体连接转化大肠杆菌 DH5α 感受态中,随机选取3个阳性菌落送至北京睿博科兴公司测序,并用 DNAMAN 进行序列比对分析。
1研究所用引物
Table1Primers used in this study
1.2.2 花花柴 KcPIF4生物信息学分析
用 NCBI网站 BLAST 功能比对 KcPIF4的氨基酸序列同其他植物的氨基酸序列相似性; 通过 EXPASY 网站的 Protscale在线工具分析亲疏水性; 用 Prosite和Interpro在线预测花花柴 KcPIF4 蛋白保守结构域; 用 ProtParam 在线预测花花柴 KcPIF4蛋白质的理化性质、等电点(pI)和氨基酸组成; 用SOPMA 在线分析预测花花柴 KcPIF4蛋白质二级结构; 用 MEME分析蛋白质的基序(motif); 用在线分析工具Signal IP5.0预测花花柴 KcPIF4蛋白质是否具有信号肽; 用 TMHMM 预测花花柴 KcPIF4蛋白的跨膜结构域; 用 MEGA11.0、MEME 和 TBtools分析几种与 KcPIF4蛋白序列相近植物之间的进化关系、蛋白系统发育及保守蛋白质基序。
1.2.3 花花柴 KcPIF4蛋白亚细胞定位
用无缝克隆的方法将KcPIF4 基因构建到pCAMBIA1302上,设计带有pCAMBIA1302载体的同源臂引物(KcPIF4-1302F和KcPIF4-1302R)。以KcPIF4T 载体质粒为模板进行 PCR 扩增目的基因,选择Bgl Ⅱ和Spe Ⅰ 2个酶对pCAMBIA1302载体进行双酶切,对酶切产物进行胶回收后与 PCR 扩增产物按照无缝克隆试剂盒(博迈德,北京)说明书加样并于50℃保温30min。连接产物转入大肠杆菌 DH5α 感受态中,挑选阳性克隆进行1代测序,测序正确后将重组质粒转入农杆菌 GV3101中。
将烟草种子用75%乙醇消毒1 min,用无菌水洗2遍后用2%次氯酸钠消毒18min,再用无菌水清洗4次,后均匀铺在 MS固体培养皿上,置于26℃人工气候培养箱中进行16h光照,8h黑暗约10 d的培养,待烟草幼苗长出 3 片真叶时进行移栽。按照3∶1比例将营养土和蛭石混合拌匀分装到花盆中,将烟草幼苗移栽到花盆中并覆上保鲜膜待2d 后扎孔,4d后去掉保鲜膜正常培养约4周后进行处理。
用烟草瞬时转化法进行亚细胞定位实验[15],切下侵染标记的叶片并置于载玻片上倒置于激光共聚焦显微镜下观察。
1.2.4 花花柴KcPIF4 高温胁迫表达量分析
花花柴种子均匀撒在营养土∶蛭石为3∶1混合土中,覆膜,待长出幼苗后戳空缓苗,2d后揭开膜28℃,16h光照,8h黑暗培养2个月。取长势相同的花花柴幼苗,分别在 45℃ 下高温处理 5 min、30min、120min、240min,每个处理3个生物学重复。处理完毕后分别采集根、茎、叶提取 RNA 并反转录获得cDNA,调整cDNA 浓度一致。
实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析45℃ KcPIF4 的相对表达量:设计qRT-PCR 引物(KcPIF4-qPCR F和KcPIF4-qPCRR),使用qRT-PCR 预混液按照 qRT-PCR试剂盒说明书(全氏金,北京)加样,并按照程序(热循环条件为95℃ 20s,95℃ 15s,60℃ 20s,40个循环; 熔解段条件为95℃ 15s,60℃ 1 min,95℃ 15s)进行反应。使用 GraphPad Prism 9.0作图。
1.2.5 过表达KcPIF4 拟南芥耐高温性分析
花花柴 KcPIF4 真核超表达载体利用 Gateway技术构建[16]。设计带有 BP-LR 的同源臂引物(KcPIF4-BPLRF和 KcPIF4-BPLR R)。利用高保真酶进行 PCR扩增,扩增体系为:95℃预变性4 min; 95℃变性30s,59℃退火30s,72℃延伸90 s,35个循环; 72℃延伸7min; 4℃冷却15min。将扩增片段通过 BP 酶转入 pDONR221载体中转化 DH5α 感受态,挑取阳性菌落活化提取质粒,并通过 LR酶转入表达载体 pK2GW7中转化 DH5α 感受态,挑取阳性菌落活化提取质粒,并转入农杆菌 GV3101中,保存备用。
用花序侵染法[17]获得过表达 KcPIF4 拟南芥植株,用PCR筛选阳性株系并扩繁得到 T3 代纯合。分别种植野生型株系和2种转 KcPIF4 拟南芥株系,待其生长至苗期时,在45℃高温下分别处理0,5,30,120,240 min。每个处理设置 3 个生物学重复,分别测定植株叶器官超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、叶绿素、相对电导率。用 Excel和 Graphpad 9.0分析处理数据。
(1)SOD、POD、CAT 和 MDA 测定使用微量法检测试剂盒(索莱宝,北京)。
(2)叶绿素:称取0.1g幼嫩的绿色叶片,剪碎放入10mL95%乙醇溶液,避光放置至叶片发白发硬。以95%乙醇溶液作为对照,采用分光光度法分别测量叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素含量[18],每个处理重复4次。
(3)相对电导率:使用浸泡法称取0.1g幼嫩的绿色叶片,剪碎后放入10mL蒸馏水中测定相对电导率含量[19],每个处理重复4次。
2 结果与分析
2.1 花花柴KcPIF4基因克隆
用1.2.1节反转录得到的cDNA 扩增,其大小与转录组片段大小基本吻合(图1),对连接T 载体并转化 DH5α的阳性菌落进行测序。测序结果分析发现KcPIF4 序列大小为1593bp,与预期序列大小相符,且与转录组数据的序列一致性达98%以上。
1花花柴 KcPIF4 PCR扩增电泳
Fig.1Gel electrophoresis of PCR amplification products of KcPIF4
M. DL5000 DNA marker;泳道1,2为KcPIF4 PCR产物。
M. DL5000 DNA marker. Lanes 1 and 2 are KcPIF4 PCR products.
2.2 花花柴KcPIF4 生物信息学分析
通过 PCR扩增获得 KcPIF4 CDS全长序列为 1593bp,编码530个氨基酸。根据 ProtParam 在线工具预测结果,KcPIF4 基因编码的核苷酸的分子式为C2435H3881N709O786S41,相对分子质量为56979.34,理论等电点(pI)为6.43。KcPIF4蛋白中正电荷残基为 49,负电荷残基为 46。ProtScale 软件显示 KcPIF4蛋白的疏水性最大值为4.500,亲水性最大值为-4.500,其中大多数氨基酸具有亲水性。NCBIBLAST 在线比对分析出 KcPIF4氨基酸序列与牛蒡(Arctium lappa)PIF4蛋白氨基酸序列一致性为71.48%,与苦菊(Cichorium endivia)PIF4蛋白氨基酸序列一致性为68.41%,与莴苣(Lactuca sativa)PIF4蛋白氨基酸序列一致性为67.51%,与黄花蒿(Artemisia annua)PIF4蛋白氨基酸序列一致性为 65.16%,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)PIF4蛋白氨基酸序列一致性为 56%。KcPIF4 与黄花蒿和飞蓬的亲缘关系最近,可信度高,同时 motif分析表明,在预测前10的 motif中,KcPIF4与拟南芥 PIF4 相比,多了 motif5、motif7、motif9 和 motif10,比玉米 PIF4多了 motif4、motif7、motif8、motif9以及 motif10,比大豆PIF4多了 motif4、 motif6、motif7及 motif9,比小麦PIF4也多 motif 4-motif9(图2)。
对 KcPIF4蛋白质二级结构进行预测分析发现该蛋白无信号肽或者跨膜结构域。且花花柴 PIF4 蛋白质的二级结构由68.11%无规则卷曲、24.15% α-螺旋、5.85% 延伸链和 1.89% β-转角组成。同时,通过Interpro和 Protsite在线分析预测结构域发现,KcPIF4蛋白序列中存在1个保守结构域,分析发现该保守结构域为螺旋-环-螺旋蛋白,在比对的十几种不同氨基酸的 PIF4序列可以发现该保守结构域只在少数菊科植物如莴苣和万寿菊中存在,而在拟南芥当中也存在这一结构域,但 KcPIF4的这一结构域与拟南芥存在个别氨基酸的差异(图3),例如,KcPIF4在位置339处含有赖氨酸(碱性氨基酸),而拟南芥 PIF4含有精氨酸(碱性氨基酸)。 KcPIF4的其他差异包括位置349处的精氨酸在拟南芥 PIF4、玉米 PIF4和小麦 PIF4中是组氨酸,在大豆中为天冬酰胺; 位置350处的赖氨酸在物种中为丝氨酸; 位置358处的谷氨酸在拟南芥PIF4中为天冬氨酸。由此,KcPIF4 保守结构域内的这些氨基酸变化可能与其蛋白质功能的差异有关。
2KcPIF4与不同植物 PIF4蛋白的系统发育分析和保守蛋白结构基序分析
Fig.2Phylogenetic analysis of KcPIF4 with PIF4 proteins from different plants and identification of conserved protein motifs
3KcPIF4与不同植物 PIF4蛋白多序列比对
Fig.3Alignment of KcPIF4 with multiple sequences of PIF4 proteins from different plants
2.3 花花柴 KcPIF4蛋白亚细胞定位分析
用无缝克隆方法构建亚细胞定位表达载体 pCAMBIA1302-KcPIF4 并转化 DH5α 感受态,挑取单菌落活化经 PCR 验证(图4)和1代测序证实连接成功。
提取 pCAMBIA1302-KcPIF4 质粒转化农杆菌GV3101,经 PCR验证转化成功后利用烟草瞬时转化法获得 KcPIF4的蛋白质亚细胞定位结果(图5),发现 KcPIF4 蛋白定位在叶片气孔保卫细胞膜上。
4pCAMBIA1302-KcPIF4 菌液 PCR电泳
Fig.4Electrophoresis of PCR products of pCAMBIA1302-KcPIF4-transformed bacterial culture
M. DL5000 DNA marker;泳道4,5为pCAMBIA1302-KcPIF4 转化DH5α菌液PCR验证结果。
M, DL5000 DNA marker. Lanes 4 and 5 show the PCR verification of pCAMBIA1302-KcPIF4-transformed DH5α bacterial culture.
5KcPIF4蛋白亚细胞定位
Fig.5Subcellular localization of KcPIF4 proteins
2.4 花花柴KcPIF4 高温胁迫qRT-PCR表达量分析
KcPIF4 在高温处理条件下(图6),qRT-PCR分析发现其相对表达量在根中表现为高—低—高趋势,在处理5min后下降幅度增大,120min时达到最低,但在处理240min时表达量升高且达到最大值,为对照组(0min)的16倍,表明处理前期 KcPIF4 在根中负响应高温,但随后能适应高温并做出积极响应; 在茎中KcPIF4 相对表达量表现为先升高后降低趋势,整体的表达量并不高,表明KcPIF4 在茎中对高温胁迫响应能力弱; 在叶中,KcPIF4 相对表达量呈现高— 低—高的趋势,在处理5min时相对表达量上升幅度增加,随后降低且低于未处理时,处理240min时,相对表达量最高,为对照组(0min)的4.4倍,表明KcPIF4 能适应高温并对高温胁迫具有正响应能力。
6花花柴根、茎、叶 KcPIF4 基因45℃处理下qRT-PCR分析
Fig.6qRT-PCR analysis of KcPIF4 gene at 45℃ in the roots, stems, and leaves of K. caspica
n=3;*表示P<0.05,**表示P<0.01;ns表示不显著。下同。
n=3, * indicates P<0.05, ** indicates P<0.01; ns indicates not significant. The same as below.
2.5 过表达KcPIF4 增强拟南芥耐高温性分析
高温胁迫表型观察发现(图7),野生型植株叶片整体较过表达株系小,在高温处理3h时,野生型和过表达 KcPIF4 株系叶片均出现部分幼叶的卷曲,处理6h时,叶片直立明显,野生型叶片开始黄化; 处理8h时,野生型叶片黄化明显,过表达株系 OE1、OE3也出现不同程度的黄化,而 OE1除叶片出现直立情况外,只有部分叶片边缘出现黄化现象,但整体来看,OE2叶片更绿,故选择 OE1、OE2株系进行后续生理生化指标测定。
过表达 KcPIF4 拟南芥的高温胁迫生理生化测定结果(图8)显示,过表达KcPIF4 株系CAT 活性先增加后降低,在30min时达到最大值,随后降低,但120 min 和 240 minCAT 活性仍高于野生型; 过表达 KcPIF4 株系 SOD 活性随处理时间增加而增加,在处理时间达240min增加量最大且仍显著高于野生型; 野生型拟南芥在未处理和5 min 时的 POD 活性高于过表达 KcPIF4 株系,但在处理30min开始低于过表达株系。MDA 含量测定结果表明,过表达 KcPIF4 株系的 MDA 含量先升高再降低,总体的变化幅度不大,但在处理120min后降低的幅度增大且显著低于野生型拟南芥; 相对电导率测定结果中,过表达株系呈现降低—升高—降低的趋势,在30min时相对电导率大于野生型,但在处理120min后显著低于野生型。
野生型拟南芥叶绿素a和叶绿素b含量随高温处理时间增加降低,而过表达株系受温度影响变化不大; 野生型拟南芥类胡萝卜素含量随处理时间变化不大,有降低趋势,而过表达株系类胡萝卜素含量随处理时间的增加呈现升高—降低—升高,处理 240min时达到最大值。
7高温(45℃)处理转化 KcPIF4 拟南芥胁迫表型
Fig.7Phenotype of Arabidopsis seedlings transformed with KcPIF4 under high temperature (45℃) treatment
A.0 h; B.3 h;C.6 h;D.8 h。WT.野生型植株; OE1、OE2、OE3.过表达植株。
A. 0 h. B.3 h. C.6 h. D.8 h. WT, wild type plants. OE1, OE2, OE3, overexpressed plants.
8转化 KcPIF4 拟南芥响应45℃高温相关生理指标
Fig.8Physiology-related indicators of Arabidopsis seedlings transformed with KcPIF4 in response to 45℃ high temperature
3 讨论
非生物胁迫会影响植物的分布和生存,而急剧的高温会影响植物的生长甚至会对其产生致死性伤害。热形态发生是近年来广泛研究的课题,植物在温度升高的过程中会通过叶柄和下胚轴的伸长以及增强叶片的蒸发冷却等缓解高温。PIF4作为一个转录调控因子,广泛参与到植物热形态建成中,目前已在多种植物中对其进行了研究。本研究对 KcPIF4 的生物信息学进行初步分析,发现 KcPIF4蛋白无跨膜结构域和信号肽,但是存在1段碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)的保守结构域。bHLHs在逆境胁迫中起着重要作用,刚毛柽柳 ThbHLH1 在应对非生物胁迫时具有抗逆性[20]; 马铃薯大部分 StPIF成员能响应生物胁迫和高温等非生物胁迫[21]; 而本课题组此前从花花柴中克隆到了bHLH71 基因,发现高温能显著诱导 KcbHLH71 基因的表达[22]。以上表明 KcPIF4 对高温等非生物胁迫具有抗逆性。
KcPIF4 本身在高温下的表达量不高,但其在拟南芥中过表达之后却能很大程度上增强拟南芥的耐高温能力。多项研究表明,PIF4能与不同基因共同参与植物热形态的建成,其中转录因子 HEMERA 和叶绿体生物发生相关因子(regulator of chloroplast biogenesis,RCB)协同作用在白天通过稳定PIF4从而启动植物热形态发生[23]; Elongated Hypocotyl5(HY5)通过抑制PIF4表达和竞争靶启动子中的PIFs 结合位点拮抗热形态发生[24]; 还能通过光敏色素因子PHYB调控植物热形态发生[25-26]。光和热之间往往具有很紧密的联系,在高温和光照条件下,PHYB 蛋白转变为生物非活性的pr型,导致 PHYB的生物活性pfr型减少,从而增加 PIF4蛋白的水平,并与关键酶基因YUCC8 的启动子结合,拟南芥生长合成素酶1(TAA1)、色氨酸非转移酶和 CY-tochrome P450 家族79b2(CYP79B2)形成生长素生物合成途径[27]。此外,PIF4也能与生长素等激素、INO80染色质重塑复合物[28]等作用从而参与植物热形态的发生。故可以通过进一步研究花花柴 KcPIF4 在热胁迫下与光反应路径或植物激素调控路径之间的关系阐释KcPIF4 的耐高温性机理。在后期研究中,可以利用基因敲除获得突变体,构建多种双元载体等分析 KcPIF4 如何增强植物耐高温能力。同时,过表达 KcPIF4 基因也可为棉花等经济作物耐高温性分子育种提供研究基础和基因资源。
有研究报道,在棉花中 PIF4定位在细胞核上调控高温下棉花花药败育[29],然而花花柴 KcPIF4 蛋白定位在气孔保卫细胞膜上,结合二级结构分析,这可能是花花柴与棉花 PIF4在功能上有所差异的原因。同时气孔的开闭由保卫细胞控制,影响气孔开闭的因素包括环境和激素[30]。从环境因素看,光照和温度均能影响气孔的开闭[31],说明 KcPIF4 基因与植物耐高温性及耐干旱性相关。研究表明,拟南芥 WRKY33-PIF4环表达受甘露醇处理的诱导[32]; 小麦PIF4 在短时间干旱处理下表达量升高[33]。因此,可以通过这一点进一步探索KcPIF4 对干旱的耐受能力以及在干旱-高温复合胁迫下的耐受能力是否更强。与此同时,PIF4对增强植物耐盐方面也具有作用,在辣椒中,PIF4参与调控辣椒的盐耐受性[34]; 在狗牙根中,PIF4会导致狗牙根的抗氧化能力降低,进而影响到狗牙根耐盐能力[35]。而番茄 bHLH89 基因在细菌中表达可以增强细菌的耐盐性[36]。这表明 PIF4 异源表达对不同植物的耐盐性上可能具有不同的作用,故可以通过进一步测定花花柴KcPIF4 对盐的耐受性,探究KcPIF4 对促进植物耐盐性是具有正向作用还是负向作用。
4 结论
(1)KcPIF4蛋白存在bHLH 保守结构域,其基序与棉花等植物同源蛋白基序不同。
(2)KcPIF4蛋白定位在叶片保卫细胞膜上。
(3)KcPIF4 在叶和根器官中正向响应高温胁迫,在茎器官中表达量低,异源表达 KcPIF4 具有增强拟南芥耐高温的能力。但对 KcPIF4 基因的耐旱等抗逆能力以及与其他因子相互作用时的抗逆能力还有待进一步研究。
1花花柴 KcPIF4 PCR扩增电泳
Fig.1Gel electrophoresis of PCR amplification products of KcPIF4
2KcPIF4与不同植物 PIF4蛋白的系统发育分析和保守蛋白结构基序分析
Fig.2Phylogenetic analysis of KcPIF4 with PIF4 proteins from different plants and identification of conserved protein motifs
3KcPIF4与不同植物 PIF4蛋白多序列比对
Fig.3Alignment of KcPIF4 with multiple sequences of PIF4 proteins from different plants
4pCAMBIA1302-KcPIF4 菌液 PCR电泳
Fig.4Electrophoresis of PCR products of pCAMBIA1302-KcPIF4-transformed bacterial culture
5KcPIF4蛋白亚细胞定位
Fig.5Subcellular localization of KcPIF4 proteins
6花花柴根、茎、叶 KcPIF4 基因45℃处理下qRT-PCR分析
Fig.6qRT-PCR analysis of KcPIF4 gene at 45℃ in the roots, stems, and leaves of K. caspica
7高温(45℃)处理转化 KcPIF4 拟南芥胁迫表型
Fig.7Phenotype of Arabidopsis seedlings transformed with KcPIF4 under high temperature (45℃) treatment
8转化 KcPIF4 拟南芥响应45℃高温相关生理指标
Fig.8Physiology-related indicators of Arabidopsis seedlings transformed with KcPIF4 in response to 45℃ high temperature
1研究所用引物
Table1Primers used in this study
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