摘要
【目的】探究百山祖冷杉种子的形态特征和物理指标与种子活力之间的关系,为研究该濒危物种种群更新、保护及解释其濒危机制和其种子生物学提供理论依据。【方法】以极度濒危植物百山祖冷杉为材料,测定百山祖冷杉种子长度、宽度、厚度、单粒重、RGB 值等特征常数,用 TTC 染色法测定其种子活力,并建立数学模型。 【结果】百山祖冷杉有活力和无活力种子的R、B 值和单粒重存在显著差异,单因素线性回归分析表明,百山祖冷杉种子活力与种子单粒重显著相关, R 2 为0.839;双因素线性回归分析表明,种子活力与种子单粒重和宽度显著相关, R 2 为0.895;多因素线性回归分析,R 2 为0.978;但其有活力种子和无活力种子长度、宽度、厚度和G 值不存在显著差异。【结论】用百山祖冷杉种子的R、B 值和单粒重等指标可筛选具有较高种子活力的种子,用多因素线性回归分析可更精确分析其种子活力。
Abstract
[Objective] This study aims to explore the relationship between seed morphological and physical characteristics and seed vigor of Abies beshanzuensis, in order to provide a theoretical basis for further population renewal and protection of this endangered species, explaining its endangered mechanism, and studying its seed biology. [Methods] Using the endangered plant A. beshanzuensis as material, characteristic constants of the length, width, thickness, single grain weight, and RGB, etc. of the seeds of A. beshanzuensis were measured. Seed vigor was determined using TTC staining method, and their mathematical models were established. [Results] Significant differences were observed in R, B values, and single seed weight between vigorous and non-viable seeds of A. beshanzuensis. Single factor linear regression analysis showed that the correlation between seed vigor and single seed weight of A. beshanzuensis was the most significant, with R2=0.839. Two factor linear regression analysis showed that seed vigor had the most significant correlation with single seed weight and width, with R2=0.895. For multivariate linear regression analysis, R2=0.978. However, no significant differences were observed in length, width, thickness, and G value between vigorous and non-viable seeds. [Conclusion] By using indicators such as R, B value, and single grain weight of A. beshanzuensis seeds, seeds with higher seed vigor can be screened. Multiple factor linear regression analysis predicts more accurately the seed vigor.
百山祖冷杉(Abies beshanzuensis)隶属松科(Pinaceae)冷杉属(Abies),是中国特有的珍稀濒危野生植物,是全球最濒危的12种植物之一,属国家一级重点保护野生植物,处于极度濒危状态。百山祖冷杉于1963年首次被发现,并在1976年正式定名发表,其分布范围狭窄,自然分布于浙江省庆元县海拔约1740m 的地区[1]。开花结实周期长且天然更新能力极弱,自然状态下繁育概率极低。在植物学、地理学、气候学等学科研究方面具有十分重要的意义[2]。TTC染色已广泛应用于测定植物器官、组织的活力,如利用 TTC 染色法测定天山云杉(Picea schrenkiana)细根[3]、葡萄枝条[4]、杨山牡丹(Paeonia ostii)[5]和长药稻(Oryza longistaminata)花粉[6]、小麦根[7]的活力。TTC 染色法也被广泛用于检测植物种子活力,如测定玉米[8]、玉兰[9]、水稻[10-12]、大麦[13]、濒危植物大别山五针松(Pinus dabeshanensis)[14]等植物种子活力。Long等[15]则利用 TTC染色法评价玉米种子活力。
种子是植物有性繁殖的重要器官,其活力直接决定植物的自然更新能力。种子活力主要受到遗传因素和环境因素的影响[16]。种子活力的强弱取决于其自身的基因型[17],而种子的基因型主要通过种子的形态特征、生理、生化及遗传机制等体现,因此种子的长、宽、厚度、RGB 值、单粒重等指标可以作为研究种子生活力的重要指标。种子形态和物理特征与种子活力存在一定的相关性[18-19],种子形态和物理特征可以预测其活力,以定量的方式代替感官描述[20]。邓贵仲等[21]探究青稞种子活力与种子形态指标之间的相关性; 薛陶[22]探究杂交籼稻种子形态及物理特征与种子活力之间的关系。种子活力决定播种量和播种质量[23],因此,生产中筛选高质量的种子降低生产成本。筛选种子最适萌发条件时,样品种子活力相差较大将直接影响试验可靠性,筛选出具有活力的种子是进行种子萌发试验的必要前提。
本研究利用百山祖冷杉种子的长度、宽度、厚度、单粒重、RGB值等7个形态和物理特征指标,并用 TTC染色法测定种子活力,对其种子有无活力的各项指标进行显著性检验,在此基础上,对各指标进行相关性分析,筛选出与种子活力具有显著相关的指标,建立百山祖冷杉种子形态和物理特征指标与种子活力间的单因素、双因素和多因素线性回归分析模型方程,绘制二维和三维散点图,直观显示种子活力与种子形态和物理特征的关系,旨在考察山祖冷杉种子形态和物理特征指标与种子活力之间的定量关系,以期为无损筛选有活力的百山祖冷杉种子提供参考。
1 材料和方法
1.1 试验材料
百山祖冷杉种子(嫁接树)采自浙江省庆元县钱江源-百山祖国家公园庆元保护中心百管站。
1.2 试验方法
1.2.1 TTC染色液配制[10]
用磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制磷酸缓冲液,用0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠调节缓冲液pH 为6.5~7.5。称取1g TTC 粉末溶于100 mL磷酸缓冲液中,再次调节pH 至6.8~7.2,将配制好的1% TTC染色液于4℃冰箱中避光保存。
1.2.2 百山祖冷杉种子 RGB值测定
随机选取百山祖冷杉种子1000粒,将种子进行编号并用摄像机在摄影箱中进行拍照,拍摄时摄像机光圈值为f/6.3,曝光时间为1/8000s。拍摄得到的照片用 Adobe Photoshop 2019读取 RGB值并记录。
1.2.3 百山祖冷杉种子长、宽、厚度、单粒重测定
1.2.4 TTC染色
TTC能与活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应,生成红色的甲臜,结果可以用来表示细胞的活力,TTC染色步骤参考文献[9,11],并作适当修改:(1)预处理,将百山祖冷杉种子的硬种皮剥去,并切去种子基部小块组织,种子25℃浸水18h。(2)TTC染色,纵向切开种子的种皮和胚乳,将切开的种子置于染色容器中,添加 TTC染色液至浸没过种子,在38℃下反应4~6h,及时观察染色完成的种子。(3)活力鉴定,染色结束后,从染色液中取出种子,用清水进行冲洗,随后观察,完全染色或大部分染色的为正常种子,按照种子编号记录染色结果。
1.3 数据处理
用 Excel软件对数据进行统计作图,用 SPSS 25.0 软件进行方差分析,用方差分析-多重比较法(LSD)进行差异显著性检验(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 百山祖冷杉种子TTC染色和观察
对百山祖冷杉1000粒种子分别进行 TTC 染色,结果(图1)所示,有活力的种子在 TTC 染色过程中种胚和胚乳均被染成深红色,且胚的颜色更深; 而没有活力的种子在 TTC 染色过程中,其种胚和胚乳则不会染色。
图1有活力种子与无活力种子的 TTC染色对比
Fig.1Comparison of TTC staining between vigorous and non-viable seeds
A.被染为红色的种子为有活力种子;B.未染色种子为无活力种子。
A. The red colored seed is vigorous seed. B. The unstained seed is non-viable seed.
2.2 百山祖冷杉种子形态物理特征参数分析
分别测量百山祖冷杉1 000粒种子的长度、宽度和厚度等指标,并对有活力种子与无活力种子的长度、宽度和厚度进行显著性检验。结果(图2)所示,百山祖冷杉有活力种子与无活力种子在长度、宽度和厚度上均没有显著性差异。
对百山祖冷杉1 000粒种子分别拍照,用Adobe Photoshop 2019读取其RGB值,分别对有活力种子与无活力种子的R、G、B值进行显著性检验。如图3所示,有活力种子与无活力种子G值没有显著性差异,但R值差异显著,B值差异极显著。
图2有活力种子与无活力种子的长度、宽度和厚度
Fig.2Comparison of seed length, width, and thickness between vigorous and non-viable seeds
图3有活力种子与无活力种子的 R、G和B值
Fig.3Comparison of R, G, and B values between vigorous and non-viable seeds
*表示显著差异(P<0.05);**表示极显著差异(P<0.01)。下同。
* indicates significant difference (P<0.05) . ** indicates extremely significant difference (P<0.01) . The same as below.
对百山祖冷杉 1000 粒种子分别称取其单粒重,对有活力种子与无活力种子的单粒重进行显著性检验,结果(图4)所示,有活力种子与无活力种子的单粒重具极显著差异。
图4有活力种子与无活力种子的单粒重
Fig.4Comparison of single seed weight between vigorous and non-viable seeds
2.3 百山祖冷杉种子 R、B 和单粒重与种子活力关系
图5所示,百山祖冷杉种子 R 值的最大值为 202,最小值为85,百山祖冷杉种子活力在131~145 组最高,但其种子活力小于 7%,在 85~100 组和 176~202组最低,为0%。百山祖冷杉种子R 值为 85~145,百山祖冷杉种子的种子活力随 R 值增长呈上升趋势; 种子R 值在101~115组与131~145 组间存在显著差异。百山祖冷杉种子R 值为131~160,种子活力随 R 值增长呈下降趋势,但 R 值在 131~145组与146~160组间差异不显著。
图5不同R 值百山祖冷杉种子活力
Fig.5Seed vigor changes of A. beshanzuensis seeds with different R values
不同小写字母表示不同R值组别之间差异显著(P<0.05)。
Different lowercase letters indicate significant differences between different R value groups (P<0.05) .
百山祖冷杉种子R 值为146~175,百山祖冷杉种子的种子活力随R 值增长又呈上升趋势,R 值在 146~160组与161~175组间差异不显著。百山祖冷杉种子R 值为161~202,百山祖冷杉种子活力随 R 值增长又呈下降趋势,且 R 值在161~175组与 176~202组间差异显著。整体而言,百山祖冷杉的种子活力随R 值增大先增大后减小。
图6不同B 值下百山祖冷杉种子的种子活力
Fig.6Seed vigor changes of A. beshanzuensis seeds with different B values
不同小写字母表示不同B值组别之间差异显著(P<0.05)。
Different lowercase letters indicate significant differences between different B value groups (P<0.05) .
图7不同单粒重百山祖冷杉种子的种子活力
Fig.7Seed vigor changes of A. beshanzuensis seeds with different single seed weight
不同小写字母表示不同单粒重组别之间差异显著(P<0.05)。
Different lowercase letters indicate significant differences between different single seed weight groups (P<0.05) .
图6所示,百山祖冷杉种子 B 值的最大值为 131,最小值为54,百山祖冷杉种子活力在 B 值为76~85组最高,但其种子活力小于10%,在106~131组最低,为0%。百山祖冷杉种子B 值为54~85,百山祖冷杉种子的种子活力随B 值增长呈上升趋势,种子B 值在54~65组、66~75组与76~85 组间存在显著差异。百山祖冷杉种子 B 值为76~95,百山祖冷杉种子的种子活力随B 值增长呈下降趋势,B 值在76~85组与86~95组间差异显著。百山祖冷杉种子B 值为86~105,百山祖冷杉种子的种子活力随 B 值增长又呈上升趋势,但 B 值在 86~95组与96~105组间差异不显著。百山祖冷杉种子B 值为96~131,百山祖冷杉种子的种子活力随B 值增长又呈下降趋势,且B 值在96~105组与106~131组间差异显著。整体而言,百山祖冷杉的种子活力随B 值增大先增大后减小。
如图7所示,百山祖冷杉种子单粒重的最大值为0.0605g,最小值为0.0121g,百山祖冷杉种子活力在0.0500~0.0605g组最高,但其种子活力小于30%,在0.0121~0.0299g组最低。百山祖冷杉种子单粒重为0.0121~0.0605g,百山祖冷杉种子的种子活力随百山祖冷杉种子单粒重增长呈上升趋势,单粒重在0.0121~0.0299g、0.0300~0.0349g、0.0350~0.0399g组间差异不显著,在 0.0350~0.0399g、0.0400~0.0449g、0.0450~0.0499g、0.0500~0.0605g组间差异显著,百山祖冷杉种子活力最高可达到23.81%。
2.4 种子形态和物理特征与种子活力相关性分析及数学模型的构建
对百山祖冷杉种子的长度、宽度、厚度、单粒重、R 值、G 值、B 值和种子活力等指标进行相关性分析,结果(表1)所示,百山祖冷杉的种子活力分别与百山祖冷杉种子 R 值、G 值、B 值和种子长度无显著相关性,但与种子宽度、厚度和单粒重指标间具极显著性正相关; 种子长度分别与宽度、厚度、单粒重呈极显著性正相关,而与 R 值为极显著性负相关,与G 值呈显著性负相关; 宽度分别与厚度和单粒重呈极显著性正相关; 厚度分别与R 值、G 值、B 值呈极显著性负相关,而与单粒重呈极显著性正相关; R 值分别与G 值、B 值呈极显著性正相关,而与单粒重呈极显著性负相关; G 值与B 值呈极显著性正相关,而与单粒重呈极显著性负相关; B 值与单粒重呈极显著性负相关。
对百山祖冷杉种子活力分别与宽度、厚度和单粒重进行单因素线性回归分析,结果表明:百山祖冷杉种子活力与种子单粒重相关性最为显著(R 2 = 0.839),其线性回归方程分别为:
(1)
(2)
(3)
式中:VAb 为百山祖冷杉种子活力; W 为单粒重; Wi 为种子宽度; T 为种子厚度。
对百山祖冷杉种子活力分别与宽度和厚度、宽度和单粒重、厚度和单粒重进行双因素线性回归分析。
表1百山祖冷杉种子形态和物理特征与种子活力相关性分析
Table1Correlation analysis between seed morphological and physical characteristics and seed vigor of A. beshanzuensis
注:**表示在0.01级别(双尾),相关性极显著; *表示在0.05级别(双尾),相关性显著。
Note: ** indicates at the 0.01 level (two tailed) , the correlation is extremely significant. * indicates at the 0.05 level (two tailed) , the correlation is significant.
百山祖冷杉种子活力与种子单粒重和宽度相关性最为显著(R 2 =0.895),其线性回归线性方程分别为:
(4)
(5)
(6)
式中:VAb 为百山祖冷杉种子活力; W 为单粒重; Wi 为种子宽度; T 为种子厚度。
用百山祖冷杉有活力种子与无活力种子的宽度和单粒重建立二维散点图,如图8所示,二维散点图中百山祖冷杉有活力种子与无活力种子的分布点有少量重叠,但能够较清楚地区分百山祖冷杉有活力种子与无活力种子。
图8百山祖冷杉有活力种子与无活力种子的二维散点图
Fig.8Two dimensional scatter plot of vigorous and non-viable seeds of A. beshanzuensis
为进一步分析百山祖冷杉种子形态和物理特征与种子活力关系,并能更好地筛选出有活力种子,进行多因素线性回归分析,R 2 可达0.978。其多因素线性回归方程为:
(7)
式中:VAb 为百山祖冷杉种子活力; W 为单粒重; L 为长度; Wi 为宽度; T 为厚度; R 为 RGB 中的 R 值; G 为 RGB中的G 值; B 为 RGB中的B 值。
R 2 值越接近1,代表拟合度越好; P<0.05,说明回归模型有意义。
用百山祖冷杉有活力种子与无活力种子的宽度、厚度、单粒重建立三维散点图,如图9所示,三维散点图中百山祖冷杉有活力种子与无活力种子的分布位置有极少量重叠,能清楚区分百山祖冷杉有活力种子与无活力种子。
图9百山祖冷杉有活力种子与无活力种子的三维散点图
Fig.9Three dimensional scatter plot of vigorous and non-viable seeds of A. beshanzuensis
3 讨论
TTC染色法是传统的种子活力检测方法[26]。由于百山祖冷杉种子坚硬、不透水,浸种前剥除种皮,才能使其胚和胚乳细胞活化,然后纵切其胚和胚乳[15],进行 TTC染色,易被 TTC染色,这与水稻种子去皮[12]相似,种子浸水时间和温度、TTC 浓度和 TTC染色时间及染色温度都会影响 TTC 染色程度[10],且不同物种的胚和胚乳细胞活化和组织活性存在差异,因此不同物种种子最佳的浸水时间和温度、TTC浓度和 TTC 染色时间及染色温度等可能会不同[15]。
植物种子活力与种子形态、物理指标相关性的研究已有较多报道。本研究结果显示,百山祖冷杉种子活力与其单粒重呈极显著正相关,与邓贵仲等[21]的青稞种子研究结果一致,但与时伟芳等[23] 研究小麦种子千粒重较小种子活力更高的研究结果不一致; 百山祖冷杉种子活力与粒宽呈极显著正相关,与邓贵仲等[21]的青稞种子研究结果相似,但与薛陶[22]研究杂交籼稻种子的结果和时伟芳等[23]小麦种子研究结果不一致; 百山祖冷杉种子活力与粒长无显著相关性,与邓贵仲等[21]的研究结果一致,但与薛陶[22]和时伟芳等[23]的研究结果不一致; 百山祖冷杉种子活力与 R 值、B 值、G 值无显著相关性。与青稞种子活力和 R、G、B 值呈负相关[21],杂交籼稻种子R 值与低温发芽率呈显著正相关的研究结果[22]不一致。
百山祖冷杉种子活力低,是其濒危的主要原因之一。其种子可育率存在大小年,小年时其可育率甚至小于1%,严重影响其种群的更新; 研究其种子生物学特性是了解其濒危机制的主要内容之一。曾有研究利用百山祖冷杉种子的重量评估其种子质量[2],但并没有深入探究百山祖冷杉种子活力与单粒重、其他形态及物理特征等的关系,本研究进一步规范地探究了百山祖冷杉种子形态及物理特征与其种子活力之间的关系。
4 结论
(1)百山祖冷杉有活力种子与无活力种子在R 值上有显著性差异; 在B 值和单粒重上有极显著差异。
(2)对百山祖冷杉种子活力分别与宽度、厚度和单粒重进行单因素线性回归分析,其种子活力与种子单粒重相关性最为显著(R 2 =0.839),其线性回归方程为:VAb=8.842W-0.258,该模型能较好地筛选有活力的百山祖冷杉种子。
(3)对百山祖冷杉种子活力分别与宽度和厚度、宽度和单粒重、厚度和单粒重进行双因素线性回归分析,百山祖冷杉种子活力与种子宽度和单粒重相关性最为显著(R 2 =0.895),其线性回归线性方程为:VAb=13.861W-0.195Wi+0.467,该模型能更好地筛选有活力的百山祖冷杉种子。
(4)对百山祖冷杉种子活力与种子形态及物理特征进行多元线性拟合,其线性回归方程为:VAb= 0.669+15.414W +0.088L-0.152Wi-0.265T+ 0.006R-0.007G-0.009B,R 2 可达0.978,可用于精确无损筛选有活力的百山祖冷杉种子。







