摘要
【目的】 分析4种霸王属植物叶绿体基因组密码子的使用模式及其成因，为深入理解霸王属植物的密码子优化、偏好机制研究及遗传进化关系提供科学依据。【方法】用CodonW、EMBOSS等对叶绿体基因组筛选出的40条基因编码序列密码子进行ENC-plot、中性绘图、最优密码子等分析。【结果】4种霸王属植物叶绿体基因组密码子的GC含量依次为GC1＞GC2＞GC3，ENC平均值都大于35，CAI均为0.17，其基因表达水平较低，且密码子使用偏好性较弱；中性绘图分析、ENC-plot及PR2-plot分析认为4个物种叶绿体基因组密码子的偏好性主要受自然选择作用的影响；最优密码子分析表明豆型霸王、长梗霸王、霸王和喀什霸王最优密码子分别有19，13，14，14个，其中4个为共有密码子且以A/U收尾。【结论】4种霸王属植物的密码子碱基多以A/U结尾，偏好性较弱且主要影响因素为自然选择，鉴定出CGA、GAA、UAU、UUA这4个共有最优密码子。
Abstract
[Objective] Codon usage bias of four Zygophyllum chloroplast genomes, and their main patterns and causes were analyzed for better understanding of the codon optimization, preference mechanism, and genetic evolution relationship of Zygophyllum. [Methods] The parity preference (PR2-plot) analysis, effective number of codons (NEC-plot), neutrality plot, and RSCU cluster analysis of 40 genes from four Zygophyllum species were carried out using CodonW, EMBOSS, and other softwares in this study. [Results] The codon usage patterns in the plastomes of four Zygophyllum species were similar, the GC content of codon was followed by GC1＞ GC2＞ GC3, the average ENC values were more than 35, and the CAI was 0.17, indicating that gene expression of the chloroplast genome of Zygophyllum species was low and codon preference was weak. The results of neutral mapping analysis, ENC-plot selection, and PR2-plot analysis showed that the codon usage pattern was predominantly affected by natural selection, which played a dominant role. RSCU cluster analysis showed that Z. fabago, Z. obliquum, Z. xanthoxylum, and Z. kaschgaricum had 19, 13, 14, and 14 optimal codons, respectively. By constructing the high and low gene expression library of the target genes, four optimal genes were selected that were ending with A/U. [Conclusion] Codon bases of the chloroplast genome from four Zygophyllum species are mostly ended with A/U. The preference is weak and the main influencing factor is natural selection. Four optimal codons, including CGA, GAA, UAU and UUA, are identified in this study.
Keywords
霸王属（Zygophyllum L.）为蒺藜科（Zygophyllaceae）的代表属，全球约有150个种[1-3]，中国有20多种[3-4]，主要分布在西北干旱半干旱区。霸王属植物耐干旱，贫瘠和盐碱，是西北地区区域生态系统的重要组成部分[2]。在中国霸王属植物以草本类为主，灌木类1~2种，这2个类群在分类上存在一定争议，即Sarcozygium Bunge和Zygophyllum L.应合并为1个属还是各自为独立的属。大部分霸王属物种主要分布在新疆，而灌木类群即霸王[Zygophyllum xanthoxylum（Bunge）Maximowicz]和喀什霸王（Z. kaschgaricum Boriss），主要分布在新疆东疆和南疆，阿勒泰地区有少量分布，此外在甘肃、青海和内蒙古也有分布。霸王属植物部分物种具有药用价值，可治疗多种疾病，如风湿病、消化不良、腹泻、发热等[5]。
叶绿体基因组具较为保守的环状结构，和核基因组间存在双向信号交流，有正向信号和逆行信号2种，且由有利于其基因表达与调控的复合操纵子结构组成[6]。叶绿体基因组中基因编码序列（coding sequence，CDS）包括DNA和RNA，每3个连续的碱基编码1个氨基酸，其序列中密码子作为生物体中递送生物体遗传信息的载体，在生物遗传变异过程中有重要作用。物种具有使用某一特定密码子的普遍现象，进而形成该物种特有的密码子使用模式，并在属内物种间有相似性。
研究表明在长期进化过程中，草本植物和木本植物的叶绿体基因组密码子的使用模式相对保守且高度相似[7]，而某些同义密码子的高频使用则形成密码子偏好性。密码子偏好性（codon usage bias，CUB）是物种对编码相同氨基酸的同义密码子的不均等使用[8]，其使用模式会对特定基因的表达水平和功能产生一定影响，以此来影响生物的表现性状。密码子使用偏好性反映了物种或基因的起源、突变模式和进化，其差异大小可以用来反映物种间亲缘关系的远近[9]。
中国霸王属植物的叶绿体基因组序列已有报道[10]，但其属内物种的密码子偏好性研究鲜见。本研究以中国霸王属的两大分支（木本分支和草本分支）中各选2个物种为研究对象，基于4个种的叶绿体基因组序列，系统地分析其密码子使用特征，探讨密码子偏好性及其影响因素，深层次分析该属叶绿体基因组数据，为以后密码子优化、偏好机制研究及霸王属遗传进化关系等研究提供思路和参考。
1 材料和方法
1.1 序列获取与筛选
将测序组装完成的4种霸王属植物，豆型霸王（Z. fabago）、长梗霸王（Z. obliquum）、霸王、喀什霸王的叶绿体全基因组序列注释并进行人工校正。筛选出4种霸王属植物的叶绿体全基因组的蛋白编码序列（coding sequence CDS序列，原则是不要重复的，长度不能小于300 bp，必须包括起始密码子和终止密码子的CDS序列。经过筛选获得40条CDS序列用做密码子偏好性分析。
1.2 试验方法
1.2.1 数据获取
基于4种霸王属植物叶绿体基因组筛选出的40条CDS序列进行数据分析。用CodonW（version 1.4.2，https://codonw.sourceforge.net/）和EMBOSS获得各基因的有效密码子数（effective number of codons，ENC）、相对同义密码子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）、密码子适应性指数（codon adaptation index，CAI）、最优密码子使用频率（frequency of optimal codons，FOP）、密码子总GC含量（GCall）、第1，2，3位的GC含量（分别以GC1、GC2、GC3表示）以及同义密码子第3位GC含量（GC3s）[11]供后续进一步数据处理。
1.2.2 判定密码子偏好性
在不同物种密码子使用偏好性分析中，有效密码子数（ENC）可反映密码子使用偏离随机选择的水平，在一定程度上反映出密码子使用偏好性强弱的特性。ENC值愈大，密码子使用偏好性则较弱，反之，ENC值愈小其偏好性越强。ENC值通常为21~60，若ENC≤35则其密码子偏好性强，而ENC＞35说明其密码子偏好性弱。CAI是用来衡量基因表达水平高低，一般CAI值为0~1，CAI越大，CUB越强；反之，CUB则越弱，一般认为密码子的GC含量越高，其CUB越强[12]。
1.2.3 ENC-plot分析
以每条CDS序列的ENC值作为纵坐标，GC3s作为横坐标绘制散点图，以密码子使用偏好性假设完全为碱基突变决定时的期望值作标准曲线进行ENC-plot分析，标准曲线计算公式为：ENC=2+GC3+29/[GC32+（1-GC3）2][13]。ENC-plot图中各基因位点的分布趋近标准曲线，表明偏好性的主要影响因素是突变；若分布远离标准曲线，则表明偏好性主要受自然选择等因素的影响[14]。
1.2.4 PR2-plot分析
PR2-plot分析用于反映突变和自然选择对密码子偏好性的影响，其中心点表示某一基因2条互补链间不存在任何突变或选择效应偏倚。将不同物种的每条CDS序列的A3/（A3+T3）作为纵坐标，G3/（G3+C3）作为横坐标通过画散点图进行PR2-plot分析，散点图的中心位置代表密码子没有偏好性时碱基的使用状态，即A的数量等于T的数量、C的数量等于G的数量，从中心点向别的基因位点分布的矢量反映该基因的偏倚方向和水平[15-16]。
1.2.5 中性绘图分析
用中性绘图分析探讨突变压力和自然选择对密码子使用模式的影响程度[14]，以CDS序列GC2与GC1平均值GC12为纵坐标，GC3作为横坐标进行中性绘图分析，若回归曲线系数等于1，反映该物种密码子偏好性是由碱基突变影响的，而回归曲线系数等于0则表示该物种密码子偏好性为自然选择所造成的[17]。回归系数为0~1，此物种的密码子偏好性为碱基突变、自然选择、其他因素（基因长度、tRNA丰度等）共同影响的结果。
1.2.6 同义密码子分析及最优密码子确定
相对同义密码子使用度（RSCU）表示某密码子实际使用频率与其理论预期使用频率的比值。若某个密码子的RSCU＞1，此密码子的实际使用频率比理论使用频率高，对应密码子使用偏好性强；RSCU=1，表示不存在密码子使用偏好性；RSCU＜1时，此密码子偏好性弱。利用RSCU值分类高频密码子与低频密码子归类统计其特征。
以密码子的ENC值作为偏好性参考的重要指标，选取升序排列后ENC值的前后两端10%的基因[15]，用TBtools提取每端10%的CDS序列，然后在此基础上建立高低表达基因库。用CodonW软件算出这2个表达库里面密码子的RSCU值和ΔRSCU值（ΔRSCU=RSCU高表达-RSCU低表达），从而确定4种霸王属物种叶绿体基因组中高频密码子（RSCU＞1）和高表达密码子（ΔRSCU≥0.08），最后满足以上2个条件的密码子确定为对应霸王属物种的最优密码子[18]。
2 结果与分析
2.1 密码子偏好性相关参数分析
4种霸王属植物叶绿体编码基因的GCall分别为37.15%、37.03%、37.25%、37.25%（表1），表明叶绿体基因组密码子偏向于使用A/U碱基。草本类豆型霸王和长梗霸王密码子中第1，2，3位的GC含量都小于50%，每1个位置GC含量存在差异，第1位碱基GC含量均最高，第3位碱基GC含量最低，木本类的霸王和喀什霸王的GC分布规律大体上相同。4种霸王物种数据分析体现出GC含量分布为GC1＞GC2＞GC3的趋势，GC3的平均含量最低，表明密码子分布不均且偏好以A/U结尾，同时密码子不同位置上的GC含量存在差异。适应指数（CAI）为0.17，即CAI值较低，结合4种霸王属植物叶绿体基因组GC含量，说明4种霸王属植物的叶绿体基因在植物细胞里面表达水平低，需要进行密码子优化以提高基因的表达水平，同时证明4种霸王属植物叶绿体基因组密码子偏好性弱。4个物种的有效密码子数（ENC）为44.30~44.62，平均为44.45，ENC值均大于35，表明这4种霸王属植物的叶绿体基因组密码子偏好性弱。指数CAI、FOP比较接近于0，CBI值均小于0，表明4种霸王属植物叶绿体基因的表达水平较低。
4种霸王属植物有效密码子数ENC值分别为32.20~53.53、33.66~55.83、32.20~53.07、32.20~55.14，其中rpl16、rps8、rps18、petD5基因的NEC值小于或略大于35，即密码子偏好性强，其他基因的密码子偏好性都偏弱。草本类豆型霸王、长梗霸王的各条CDS序列GC含量虽略有差异，但是差异非常小，而木本类霸王和喀什霸王的CDS序列GC含量接近完全相同（图1），显示亲缘关系较近。
表14种霸王属植物叶绿体基因组密码子各位置碱基含量及参数
Table1Codon parameters of chloroplast genomes in four Zygophyllum species
注：CAI.密码子适应指数；CBI.密码子偏性指数；FOP.最佳密码子使用频率。
Note: CAI, codon adaptation index. CBI, codon bias index. FOP, frequency of optimal codons.
图14种霸王属植物叶绿体基因组GC含量、ENC分布
Fig.1Distribution of GC content and ENC value of chloroplast genes in four Zygophyllum species
对4种植物的叶绿体基因组中碱基组成参数进行相关性分析，可判断影响密码子偏好性差异的关键因素。叶绿体基因组中碱基组成参数的相关性分析结果（图2）表明GC1和GC2呈极显著正相关，GC1和GC3，GC2和GC3无显著性相关，说明密码子第1位碱基和第2位碱基组成相似，而第3位碱基与第1位碱基、第2位碱基的组成有一定差异。
4种霸王属植物的GC3与ENC、GCall的相关性极显著（0.05），相关系数分别为0.691、0.674、0.695、0.670，即密码子第3位碱基与ENC联系紧密，并且其组成影响基因整体GC含量，同时对密码子使用偏好性有重要影响。ENC与GC1和GC2之间没有显著相关性，4种霸王属植物的叶绿体基因组密码子的偏好性受密码子第3位碱基的影响作用强，3个碱基位置之间使用有差异性，故偏好性主要受自然选择的影响。
图24种霸王属植物叶绿体密码子各位置GC含量、ENC值相关性分析
Fig.2Correlation analysis of GC content and ENC value of chloroplast genes in four Zygophyllum species
图34种霸王属植物叶绿体基因组的ENC-plot分析
Fig.3ENC-plot analysis of chloroplast genomes in four Zygphyllum species
2.2 影响密码子偏好性因素分析
2.2.1 ENC-plot分析
4种霸王属植物叶绿体基因组密码子的ENC-plot分析发现大多数基因偏离期望曲线（图3）。4种霸王属植物的基因中，仅有2种木本类物种的基因分布在标准曲线上且接近标准曲线的数量较少，但草本类豆型霸王和长梗霸王基因的ENC实际值接近标准曲线的比较多，这些基因分布和接近标准曲线，表明ENC实际值接近预期值，密码子偏好性主要受到碱基突变的影响。但是这4个物种较多的叶绿体基因偏离ENC期望值标准曲线，且多数位于标准曲线下方，说明这些基因的ENC实际值和预期值之间存在一定差异，密码子的使用偏好性主要受自然选择或其他因素的影响。因此，综合判断这4种霸王属植物叶绿体基因组基因密码子的使用偏好性主要受自然选择的影响，也包括碱基突变的作用。
4种霸王属植物分别有25，22，22，22个基因分布在0.05~0.15分区，频率分别为62%、55%、55%、55%；其次是基因分布在（-0.05）~0.05和0.15~0.25分区，其他分区基因很少（表2），说明ENC的实际值跟预期值之间存在比较大的差异，表明这些基因的密码子偏性主要受到选择压力的影响。该结果进一步说明这4种霸王属植物叶绿体基因的密码子偏性主要受到自然选择的影响。
碱基突变并不是影响这4种霸王属植物密码子偏好性的主要因素，自然选择作用对密码子的影响较大，推测4种霸王属植物叶绿体基因组密码子使用模式的表达是自然选择、碱基突变等共同作用的结果，但自然选择为主要影响因素，同时发现2种草本类霸王受到碱基突变影响的程度比2种木本类霸王弱。
2.2.2 PR2-plot分析
4种霸王属植物叶绿体基因组的PR2-plot结果比较相似，且主要分布于G3/（G3+C3）＞0.5和A3/（A3+T3）＜0.5的区域内，即在垂直方向上多数基因在中线的下方；在水平方向上基因稍微偏向于中线右侧，垂直方向分布差异较大（图4）。
表2ENC比值频数分布
Table2Distribution of ENC ratio
图44种霸王属物叶绿体基因组PR2-plot分析
Fig.4PR2-plot analysis of chloroplast genomes in four Zygophyllum species
4 种霸王属植物叶绿体 CDS基因不存在均匀分布的情况，每个密码子里碱基 A、G、C、T 的使用频率是不等的。大部分基因分布在 AC 区域（图4），说明4种霸王属植物叶绿体基因组密码子中的第3位碱基使用频率碱基 G 频率大于C，T（U）频率大于 A，大部分基因偏离中心点的矢量距离远，表明这4种霸王属植物叶绿体基因组密码子偏好性形成源于碱基突变和自然选择共同作用的影响。
2.2.3 中性绘图分析
4 个物种的所有基因均落于坐标轴对角线的上方，均有 1 个基因沿对角线分布，豆型霸王 GC12、 GC3 的数值分布在0.32975~0.52880、0.13240~0.38000范围内，长梗霸王 GC12、GC3 数值分布在0.32774~0.52540、0.13240~0.36260范围内，霸王 GC12、GC3 数值分布在0.3326~0.5324、 0.1370~0.3826范围内，喀什霸王 GC12、GC3 数值分布在0.3326~0.5324、0.1370~0.3826范围内（图5）。4种霸王属植物数据分布范围大体相近，凸显4种霸王属植物叶绿体基因组相似度高，并且霸王和喀什霸王这2种木本类霸王数值完全一致。
4 种霸王属植物中性分析中其回归系数分别是0.37 9、0.396、0.390、0.388（图5），且 GC12 和 GC3 均无显著相关性，表明自然选择对密码子的使用为主要原因。GC12 和 GC3 的分布范围在图中较狭小，碱基突变对4种霸王属植物叶绿体基因组密码子使用偏好性的影响程度比较小，其斜率分别为 0.199、0.122、0.153、0.160，说明碱基突变对4种霸王属植物叶绿体基因组密码子使用偏好性影响占 12.2%~38.8%，自然选择和其他因素对密码子的偏好性影响占61.2%~87.8%。中性绘图分析结果表明4种霸王属植物叶绿体基因组密码子使用偏好性主要影响因素是自然选择，碱基突变等对密码子偏好性的影响比自然选择小。
2.3 最优密码子分析
同时满足高频密码子和高表达密码子的为最优密码子，即当RSCU>1且ΔRSCU≥0.08的就是最优密码子。4种霸王属植物叶绿体基因组密码子 ΔRSCU≥0.08的高表达密码子分别有23，25，23，21个（表3），长梗霸王最多有25个，喀什霸王最少有21个，结合叶绿体基因组中前面筛选出的豆型霸王和长梗霸王的29个高表达密码子，霸王和喀什霸王的28个高表达密码子。
图54种霸王属植物叶绿体基因组的中性分析
Fig.5Neutrality plot analysis of chloroplast genomes in four Zygophyllum species
表34种霸王属植物叶绿体基因组最优密码子分析表
Table3Putative optimal codons in the chloroplast genome of four Zygophyllum species
豆型霸王有 19 个最优密码子（AGA、AAA、 UCA、UAU、UGU、GUU、CCU、UUU、AUU、 CAU、GCU、GGU、GAA、CGA、GUA、GCA、ACU、 UUA、UCU），长梗霸王有13个最优密码子（AAU、 GAA、GCU、CUU、GGA、UUU、ACA、CAU、 AGA、UAU、CGA、UCA、UUA），霸王有14个最优密码子（AAA、GAA、AUU、GUA、GGU、UAU、 CUU、CGA、UCU、GUU、GCU、ACU、UUA、 CCU），喀什霸王有14个最优密码子（AGA、AAU、 UAU、CGA、CGU、CAU、CUU、UUA、GAA、 GGA、ACA、GCA、UCU、GUU），4个物种共有最优密码子为4个，分别是 CGA（精氨酸）、GAA（谷氨酸）、UAU（络氨酸）、UUA（亮氨酸），4种最优密码子碱基第3位均以 A/U 收尾。
3 讨论
通过对4种霸王属植物叶绿体基因组筛选出的 40条 CDS的碱基组成及密码子偏好性分析，发现密码子碱基第1，2，3位的 GC含量都小于50%，且为 GC1>GC2>GC3，说明3个位置上的密码子分布不均且偏好以 A/U 结尾，此研究结果与棕红悬钩子[19]、辽细辛[20]、樟叶越桔[21]等结果一致。4种霸王属植物 ENC平均值和 CAI值说明密码子的偏好性弱，叶绿体基因组的表达水平低，这与马家柚[22]、菠萝蜜[23]、山麦冬叶[24]、两型豆属植物[25]的研究结果一致，在此推断植物叶绿体基因组密码子偏好性弱是大部分植物普遍存在的情况，很可能跟植物叶绿体基因组的保守程度高有关系。
对4种霸王属物种密码子偏好性影响因素分析认为自然选择、其他因素和碱基突变一起作用的结果，其中自然选择的影响程度大，这和显齿蛇葡萄[26]、滇重楼[27]、思茅松[28]的研究结果一致，说明自然界的植物叶绿体密码子偏好性形成的原因普遍具有复杂性，是多因素叠加的结果。ENC-plot和 ENC比值频数分布的分析发现大部分基因的 ENC 值与期望值差异比较大，其密码子主要受到自然选择的影响，这与 ENC 枸杞[29]、珙桐[30]、伊犁郁金香[31]等的密码子偏好性分析结果一致，而同为典型的干旱区植物的裸果木的 NEC-plot分析表明其密码子偏好性主要受到自然选择和突变的影响[32]，说明不同物种，或同域分布的不同物种的密码子使用的偏好性存在种间差异。PR2-plot分析表明其密码子使用偏好性受到自然选择的作用，还有碱基突变等因素共同作用的结果，这与棕红悬钩子[19]、柏科植物[33]等研究结果一致。4 种霸王属植物密码子组成而言，木本物种霸王和喀什霸王有较近的亲缘关系，草本类群的长梗霸王和豆型霸王则没有在密码子组成上表现出较近的亲缘关系。
4种霸王属植物共有的密码子为4个，且最优密码子主要以 A/U 收尾，第3位碱基对 A/U 的使用有极强的偏好性，这和裸果木[32]、香花油茶[34]、复羽叶栾树[35]的研究成果一致，但与白羊草叶[36] 的研究结果不同，说明叶绿体基因组密码子的偏好性存在种间差异，可能与霸王属植物的生长环境、基因功能和进化历史有关。从氨基酸角度看，4种霸王属植物叶绿体基因组中 UCU 编码的丝氨酸比例高，GGC编码的甘氨酸比例低，这与其他物种的趋势相似，推测可能是由于 UCU 编码的丝氨酸在蛋白质结构中的位置较多，而 GGC 编码的甘氨酸相对较少; UUA 编码的亮氨酸比例较高，CGG 编码的精氨酸比例较低，这与其他物种的趋势略有不同，推测可能是由于霸王属植物在进化过程中，对亮氨酸的需求较高，而精氨酸的需求较低。
4 结论
4种霸王属植物叶绿体基因组筛选出的40条 CDS的碱基组成及密码子偏好性分析，密码子碱基第1，2，3位的 GC含量依次为 GC1>GC2>GC3，3 个位置上的密码子分布不均且偏好以 A/U 结尾密码子，叶绿体基因组的表达水平低，其密码子的偏好性弱并且密码子的偏好性主要受自然选择影响; 4 种霸王属植物分别有19，13，14，14个最优密码子，其中共有最优密码子4个且以 A/U 收尾。
