摘要
【目的】 阐明蕨类植物中演化地位特殊类群海金沙受精作用的特点和细胞学机制，以完善蕨类植物生殖生物学的细胞学研究。【方法】采用包埋和透射电镜技术，对海金沙受精过程中精子入卵、核融合、受精卵膨胀和极性分化阶段进行超微结构观察。【结果】海金沙卵细胞无典型的卵膜和受精孔，精子通过孔区位置进入卵细胞。第1个精子进入卵细胞的细胞质，有2~6个精子也可通过孔区进入卵细胞孔区下方的受精腔，但无法与卵细胞融合。精子进入卵细胞后，卵细胞剧烈收缩，阻止其他精子进入，在受精腔上方孔区位置形成1层膜结构，能一定程度上阻挡其他精子进入受精腔。精子进入卵细胞后30 min开始进行核融合，精子的细胞核最初集中在卵核的一端，逐渐渗透进入卵核，随受精卵膨胀继续核融合。受精10 h左右，合子产生大量液泡，先建立垂直极性，后转为水平极性，并进行合子第1次分裂。【结论】海金沙进行受精作用时，精子从孔区位置进入，产生受精腔，其受精过程与核心薄囊蕨相似。
Abstract
[Objective] The study aims to elucidate the characteristics and cytological mechanisms of fertilization in the evolutionary special group of fern Lygodium japonicum. [Methods] Using embedding and electron microscopy techniques, ultrastructural observation was performed on the stage of sperm entry into the egg, nuclear fusion, egg expansion, and zygote polarity establishment during the fertilization process of L. japonicum. [Results] L. japonicum didn't have the typical egg envelope and fertilization pore, and spermatozoa penetrated the egg through the pore region. The first spermatozoon entered the cytoplasm of the egg, and 2-6 spermatozoa could also pass through the pore region to enter the fertilization cavity below the pore region of the egg, but could not fuse with the egg cytoplasm. After sperm entered the egg, the fertilized egg shrinked markedly to prevent the entry of other sperms, and a membrane structure was formed at the pore region above the fertilization cavity, blocking the entry of other sperms into the fertilization cavity. Nuclear fusion was initiated 30 min after spermatozoa entered the egg cell. The nucleus of spermatozoa was initially concentrated at one end of the nucleus and gradually penetrated into the nucleus of the egg, and nuclear fusion continued as the fertilized egg were expanding. Around 10 h after fertilization, the zygote produced a large number of vesicles, which first established vertical polarity and then changed to horizontal polarity, and underwent the first division of the zygote. [Conclusion] When L. japonicum undergoes fertilization, spermatozoa enters from the pore region and produces a fertilization cavity, similar to the core leptosporangiatae.
Keywords
蕨类植物是植物界中的特殊类群，其孢子体和配子体都可独立生存，配子体上可产生精子器和颈卵器，精子器成熟后释放精子，精子游动到颈卵器内与卵细胞结合产生受精卵，进入孢子体世代[1]。与其他植物类群相比，蕨类植物的受精过程知之甚少。受精作用是雌雄配子结合产生具有分裂能力合子的过程，包括精子入卵、核融合、受精卵膨胀、受精卵极性建立等过程[2]。对于蕨类植物受精作用的研究，在紫萁（Osmunda japonica）[3]、水蕨（Ceratopteris thalictroides）[4-5]、蕨（Pteridium aquilinum）[6-9]、带领蹄盖蕨（Athyrium filix-femina）[10]和蘋（Marsilea vestita）[11]中有相关报道。其中，人们最为关注的问题就是精子进入卵细胞的位置及阻止多精受精的方式。在水蕨中发现受精孔之前，Fasciati等认为带领蹄盖蕨精子通过螺旋运动在卵膜上钻孔进入卵细胞内，与蕨相同都产生受精腔[10]；后来Cao等在水蕨卵细胞上发现了受精孔，观察到水蕨精子通过受精孔进入卵细胞内，并通过产生同心圆膜囊泡封堵受精孔，阻止其他精子继续进入卵细胞[4-5]；而紫萁没有受精孔和卵膜，紫萁受精后通过产生囊泡向外延伸扩大，在受精卵上方形成空泡阻止多精受精[3]。
海金沙（Lygodium japonicum）是海金沙科（Lygodiaceae）的代表植物，其演化位置比较特殊[12]，介于里白目与核心薄囊蕨之间[13]。郭严冬等[14-15]对其配子体发育及卵发生过程进行过详细的研究，并对其进行组织化学染色，发现海金沙无卵膜和受精孔的结构，但有孔区的存在。作为无卵膜和受精孔的紫萁，与有卵膜和受精孔的水蕨之间的过渡类群，海金沙的受精方式是未知的。因此，本研究对海金沙的受精过程以及精子进入卵细胞的位置和阻止多精受精的方式等关键问题进行了详细观察，以期完善蕨类植物生殖生物学的细胞学研究。
1 材料和方法
海金沙孢子采自福建省福州市，凭证材料保存于上海师范大学蕨类植物实验室。孢子经5% NaClO消毒后接种于改良Knop's固体培养基上，置于ZRX-300E 智能人工气候培养箱内培养，光照18 h（26℃），黑暗6 h（20℃）。记录其精子器成熟释放精子的时间及颈卵成熟打开所需要的时间。在精子器和颈卵器均发育成熟时，标记成熟颈卵器的位置，在培养皿内加入适量纯水，使颈卵器颈部开口完全浸入水中，精子器释放精子游动到颈卵器开口处，在显微镜下可明显看到精子聚集在颈卵器开口处，当第1个精子进入卵细胞时开始计时，分别在受精3 min、30 min、1 h、2 h、10 h、12 h取出对应颈卵器，置于2.5%的戊二醛中固定。
在戊二醛中固定6 h以上，采用常规方法进行包埋[16]。用0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗3次后置于0.2 mol/L磷酸缓冲液和2%锇酸1∶1混合溶液中再固定2 h，经0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗3次，梯度丙酮（50%、70%、90%、100%）脱水后，使用Spurr's树脂渗透包埋，经73℃聚合9 h得到包埋块。半薄切片（PowerTome XL）定位，并选取合适时期的切片用甲苯胺蓝染色，光学显微镜（Olympus）拍照。选取合适时期的包埋块进行超薄切片（PowerTome XL），饱和醋酸铀和柠檬酸铅染色后用Hiachi-600透射电镜进行观察照相。
PAS染色时将切片经1%高碘酸氧化30 min，纯水冲洗，希夫试剂染色30 min后，纯水冲洗1 min，再经Na2SO3漂洗液漂洗3次，每次20 min，最后用纯水冲洗3 min，自然晾干后观察，光学显微镜（Olympus）拍照。
2 结果与分析
2.1 精子入卵
海金沙成熟颈卵器由颈沟细胞、腹沟细胞和卵细胞组成，无卵膜和受精孔，但有孔区存在，甲苯胺蓝染色表明卵细胞上方沉积了1层不定形物质（图版Ⅰ，A），PAS反应表明这层不定形物质为多糖类，孔区上方无多糖类物质覆盖（图版Ⅰ，B、C）。颈卵器成熟后颈沟细胞和腹沟细胞退化，卵细胞向下凹陷，呈月牙形，与周围细胞壁分离，孔区处无膜覆盖，为受精做准备（图版Ⅰ，B）。卵细胞成熟后，颈卵器口部打开，向外吐出沟细胞内容物，精子器释放的精子游动到颈卵器颈部开口处，在3 min左右精子穿过颈卵器颈部从孔区位置进入卵细胞（图版Ⅰ，3），第1个精子进入卵细胞的细胞质内，受精卵剧烈收缩，体积减小到原来的1/2，后续进入的精子也可通过孔区，在孔区下方，形成1个凹陷的受精腔，直径6~8 μm，可进入2~6个精子，但已经无法进入到卵细胞细胞质内（图版Ⅰ，D）。此时卵细胞细胞质变得致密，无法观察到卵细胞内的细胞器；可见部分鞭毛等精子细胞器，细胞核为长条状，受精腔下方有大量小泡，上方形成1层多糖类膜结构，对阻挡后续的精子进入受精腔也有一定的作用（图版Ⅰ，C、E）。
2.2 核融合
精子入卵后约30 min，受精腔和腔内精子依然存在，受精卵持续收缩，细胞质仍然致密，分辨不出其中的细胞器。精核从卵细胞的一边逐渐渗透入卵核，此时精核与卵核开始融合；与卵核相比，精核染色更明显，容易识别，此时精核大部分已进入卵核（图版Ⅰ，F）。
2.3 受精卵膨胀
核融合之后，受精卵的细胞核变得非常不规则，精子的鞭毛等细胞器留在核外，受精腔仍然存在，受精卵逐渐膨胀，细胞核上方出现大量空泡（图版Ⅰ，7）。在这个过程中核外突一直存在，受精卵内细胞器逐渐可见，其中最明显的为椭圆形或球形的线粒体，受精卵与周围细胞壁空隙变小（图版Ⅱ，A）。
受精后约2 h 受精卵液泡化程度增强，膨胀明显，受精腔被挤压，内部空隙减少，未受精精子仍留在腔内，受精卵与周围细胞壁完全贴合，细胞核高度不规则，受精腔下方及受精卵内部空泡逐渐变多变大（图版Ⅱ，B），精核和卵核刚融合时精核聚集在合子的一端且染色加深，卵核大部分集中在另一端，精子细胞器还未降解，仍存在于受精卵细胞质内，核外突仍然存在，合子周围有丰富的线粒体，呈球形或椭圆形（图版Ⅱ，C）。
2.4 受精卵极性建立
受精后10 h 左右，受精腔被完全挤压，腔内精子被挤压到受精卵上方，细胞核仍不规则，核仁明显，出现2个核仁的现象，在合子上方产生大量液泡，细胞核及非液泡的细胞器位于合子下方，建立垂直极性（图版Ⅱ，D）。核外突仍然存在，精子细胞器降解（图版Ⅱ，E）。随着发育，小的液泡逐渐合并为大液泡，移动到受精卵的一侧，细胞核及其他细胞器移动到受精卵的另一侧，由垂直极性转变为水平极性，受精腔内精子继续被挤压（图版Ⅱ，F）。最终随着合子第1次分裂，受精腔内精子将死亡并逐渐退化。
3 讨论
3.1 精子入卵的方式
最初的研究认为，精子通过螺旋运动钻过卵膜进入卵细胞内[10]，后来Cao等在水蕨上发现了受精孔，并证明受精孔就是精子进入卵细胞的位置[4-5]，目前的研究发现有受精孔的蕨类受精作用是通过受精孔进入卵细胞内[5，7，10]。Duckett等[6]和Bell[8]在蕨的受精过程中发现了受精腔。海金沙没有卵膜和受精孔，但有孔区存在，本研究表明海金沙精子通过孔区位置进入卵细胞内，第1个进入的精子直接进入卵细胞质与卵融合，第1个精子进入后未能阻挡其他精子继续通过孔区，但后续进入孔区的精子已经不能与卵细胞质结合，在孔区下方卵细胞质外产生1个受精腔，受精腔内可进入2~6个精子，受精腔上方孔区位置会产生1层膜结构，之后的精子无法再继续进入受精腔内。曹建国等认为受精腔的形成原因可能是由成熟卵子产生囊泡聚合而成[9]，精子的螺旋运动和搅拌也可能加速了受精腔的形成和扩大。
3.2 阻止多精受精
进行有性生殖的生物发展出阻止多精受精的方式。就蕨类植物目前的研究来看，紫萁作为较为原始的蕨类植物，没有卵膜和受精孔，通过产生囊泡向外延伸扩大阻挡在受精卵上方阻止多个精子的进入[3]。水蕨作为有卵膜和受精孔的代表通过产生囊泡堵住受精孔阻止多精进入[4]。海金沙无卵膜和受精孔，但其受精方式与其他核心薄囊蕨类似。曹建国等将阻止多精受精的可能机制总结为3个方面：首先是第1个精子穿透卵细胞的长时间螺旋运动阻碍了多个精子的进入；其次是在第1个精子进入后，卵细胞发生剧烈收缩，体积可以减小为原来的1/2，这种固缩不利于其他精子的进入，这也是所有蕨类阻止多精受精的共同机制和关键；最后是受精腔和卵细胞之间的膜质结构也阻挡了受精腔内精子的进入[9]。本研究还认为虽然可以有少量精子进入受精腔内，但受精腔上方孔区位置产生的1层膜结构对于阻挡大量精子进入受精腔也起到一定作用。
3.3 核融合和合子形成
对于核融合的方式不同学者有不同的解释，Bell认为蕨精子进行核融合时，精核的前端首先与卵核进行融合[8]，Fasciati等发现带领蹄盖蕨的精核通过螺旋运动钻入卵核[10]，Lopez-Smith和Renzaglia认为美洲水蕨（C. richardii）精核通过形成1个环状空间，并在此空间内逐渐与卵核融合[17]，Cao等在水蕨中观察到卵核通过伸出突起主动延伸到精核表面进行核融合[4-5]。从本研究中可以看出，在海金沙精子入卵进行核融合时，卵细胞细胞质致密，卵核呈长条状，精核逐渐渗入卵核的一端，最初主要集中在合子的一端，合子另一端大部分为卵核，随着受精卵的膨胀逐渐融合，合子变得不规则。
核融合以后，精子的多层结构、鞭毛等细胞骨架仍然留在卵细胞中，在开始极性分化前消失，核外突在整个过程中一直存在，极性分化由初期的垂直极性逐渐变为水平极性，海金沙精子细胞器降解和极性分化的时间要早于水蕨[4]，因此海金沙整个受精完成时间较快，12 h之后开始合子第1次分裂，第1次分裂垂直于配子体顶端。
4 结论
海金沙作为介于里白目与核心薄囊蕨之间的特殊类群，无典型卵膜和受精孔结构，在卵细胞上方沉积了1层多糖类物质，有孔区存在；进行受精时，精子从孔区位置进入卵细胞，并产生受精腔；精子入卵后经过核融合、受精卵膨胀、极性建立等过程完成受精作用，整个受精过程与核心薄囊蕨相似。
图版Ⅰ 精子入卵和核融合
Plate Ⅰ Spermatozoa enters the egg and nucleus fuses
A.颈卵器；B.成熟卵细胞；C.PAS染色；D.精子入卵；E.受精腔及腔内精子；F.核融合；G.受精卵开始膨胀，卵核不规则。
Eg.卵；FC.受精腔；Fl.鞭毛；Ncc.颈沟细胞；Ne.卵核；Ns.精核；PR.孔区；SP.精子；Vcc.腹沟细胞；Ve.囊泡。
Fig.A. Archegonium. Fig.B. Mature egg cell. Fig.C. PAS reaction. Fig.D. Spermatozoa enters the egg. Fig.E. Fertilization cavity and intracavitary spermatozoa. Fig.F. Nuclear fusion. Fig.G. Egg expanding and the nucleus of egg is irregular.
Eg, egg. FC, fertilization cavity. Fl, flagella. Ncc, neck canal cell. Ne, nucleus of egg. Ns, nucleus of spermatozoid. PR, pore region. SP, spermatozoid. Vcc, ventral canal cell. Ve, vesicles.
图版Ⅱ 合子膨胀和极性分化
Plate Ⅱ Zygote expanding and polarity establishment
A.合子周围线粒体及核外突；B.受精卵膨胀；C.精核和卵核之间存在大量鞭毛；D.受精卵继续膨胀，建立垂直极性，存在2个核仁；E.核外突仍然存在，精子细胞器消失；F.合子建立水平极性。
FC.受精腔；Fl.鞭毛；M.线粒体；Nz.合子；Nus.核仁；Nev.核外突；SP.精子；Ve.囊泡。
Fig.A. Mitochondria and nuclear evaginations around zygote. Fig.B. Zygote expanding. Fig.C. Flagella between nucleus of egg and spermatozoid. Fig.D. Zygote continues expanding, establishment of vertical polarity, and the zygote presence of two nucleolus. Fig.E. Nuclear evaginations remain and sperm cell organelles disappear. Fig.F. Zygote establishment horizontal polarity.
FC, fertilization cavity. Fl, flagella. M, mitochondria. Nz, nucleus of zygote. Nus, nucleolus. Nev, nuclear evaginations. SP, spermatozoid. Ve, vesicles.
