摘要
【目的】建立以环糊精为流动相添加剂的高效液相色谱法测定积雪草药材中三萜类化合物积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B的含量,为控制积雪草的质量提供依据。【方法】采用分子设计方法优选流动相添加剂-环糊精种类,效应面法分析环糊精浓度、流动相中乙腈的比例、流动相 pH 对分离的影响,优化色谱条件,测定积雪草中积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B含量。【结果】优化后 HPLC色谱测定方法以γ-环糊精为流动相添加剂, 固定相为 CAPCELL PAK C18 柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-3mmol/L 环糊精溶液(含0.10%磷酸)=20∶80(V/V),流速1.0mL/min,柱温25 ℃,检测波长205nm;羟基积雪草苷和积雪草苷 B分离度为4.32; 积雪草苷为200~2000ng,积雪草苷 B为120~1200ng,羟基积雪草苷为200~2000ng内线性关系良好,方法精密度、重现性、稳定性和回收率良好。【结论】新 HPLC色谱测定方法简便、准确、可靠,且经济环保,可用于测定积雪草药材中主要三萜类化合物。
Abstract
[Objective] In order to provide a basis for quality control of Centella asiatica (L.) Urban, a high-performance liquid chromatography method was established using cyclodextrin as a mobile phase additive for the determination of asiaticoside, madecassoside, and asiaticoside B. [Methods] Molecular design was used to optimize the type of the mobile phase additive-cyclodextrin. The response surface method was used to analyze the effects of cyclodextrin concentration, the proportion of acetonitrile in the mobile phase, and pH of the mobile phase on separation, as well as to optimize the chromatographic condition. The optimized chromatographic condition was used to determine the content of asiaticoside, madecassoside, and asiaticoside B in C. asiatica. [Results] In the optimization of determination method, γ-cyclodextrin was used as a mobile phase additive. The separation of asiaticoside, asiaticoside B, and madecassoside was carried out on CAPCELL PAK C18 (150 mm×4.6 mm, 5 μ m) with acetonitrile-3 mmol/L γ-cyclodextrin solution (contained 0.10% phosphoric acid) (20∶80, V/V). The detecting wavelength was 205 nm. The flow rate was set at 1.0 mL/min and the column temperature was 25 ℃. The resolution of madecassoside and asiaticoside B was 4.32. Linearity was good in the range of 200-2000 ng for asiaticoside, 120-1200 ng for asiaticoside B, and 200-1200 ng for madecassoside. The precision, reproducibility, stability, and recovery rate of method were good. [Conclusion] The new method is simple, accurate, reliable, and environmentally friendly, and can be used as a quality control of major triterpenoid compounds in C. asiatica (L.) Urban.
积雪草药材为伞形科植物积雪草 [Centella asiatica（L.）Urban]的干燥全草，具有清热利湿、解毒消肿的功效，用于治疗湿热黄疸、中暑腹泻、石淋血淋、痈肿疮毒、跌扑损伤等[1]。现代药理研究发现，积雪草三萜类化合物具有抗抑郁、抗肿瘤、抗胃溃疡、抗阿尔茨海默病、促进皮肤系统修复、增强心血管系统等作用，是积雪草的主要活性成分[2-4]。积雪草三萜类化合物主要包括积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草苷 B、积雪草酸和羟基积雪草酸等化合物[5]。《中国药典》2020年版通过测定积雪草苷和羟基积雪草苷以控制积雪草药材的质量[1]。但是，羟基积雪草苷和积雪草苷 B是同分异构体，不易分离，所以控制积雪草药材质量比较困难。
环糊精具有“外亲水、内疏水”的筒状结构，作为高效液相色谱流动相添加剂，可与分析物产生包合作用，改善同分异构体的分离[6]，甚至用于拆分手性对映体[7-8]。作为流动相添加剂，环糊精的种类和用量、有机相的比例等因素会影响异构体的分离效果[9-10]。因此，本研究拟采用分子设计方法优选流动相添加剂环糊精的种类，BoxBehnken 效应面法分析流动相中环糊精用量、有机相比例等因素对羟基积雪草苷和积雪草苷 B分离的影响，从而建立环糊精流动相添加 HPLC 法测定积雪草药材中的积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B 的含量，为积雪草药材质量控制提供新方法。
1 材料和方法
1.1 试验材料
积雪草药材购自西安市中药店，产地为陕西、云南和江苏，经西安交通大学牛晓峰教授鉴定为伞形科植物积雪草[C.asiatica（L.）Urban]的干燥全草。积雪草苷（纯度为99.0%）、羟基积雪草苷（纯度为99.0%）和积雪草苷 B（纯度为99.0%）对照品购自西安开来生物有限公司，γ-环糊精（γ-CD）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙腈（色谱纯）购自 TEDIA公司，甲醇和磷酸等均为分析纯，购于西安化学试剂厂，纯净水为 Milli-Q超纯水系统制备。
1.2 试验仪器
研究所用仪器有日本岛津 LC-10A 高效液相色谱仪、SPD-10Avp检测器、LC solution色谱工作站。梅特勒-托利多公司 AB135-S电子分析天平（精度 1/10000），广东凌生公司2500C 粉碎机，深圳福洋科技有限公司 F-080超声仪。
1.3 试验方法
1.3.1 供试品溶液制备
取积雪草药材适量，粉碎，过二号筛[孔径（850 ±29）μm]，准确称取1.0g，置于索氏提取器中，用适量石油醚加热回流提取6h，弃去石油醚; 然后，加入80%甲醇加热回流提取6h，80%甲醇转移至蒸发皿中，蒸干; 残渣加适量 80% 甲醇转移至 20 mL量瓶中，定容，即得供试品溶液。
1.3.2 混合对照品溶液制备
取积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B对照品适量，精密称定，置于同一量瓶中，加甲醇制成每 1mL含积雪草苷1.0mg、羟基积雪草苷1.0mg和积雪草苷 B0.6mg的混合对照品储备液。吸取上述对照品储备液1mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀释成每1mL含积雪草苷100μg、羟基积雪草苷 100μg和积雪草苷B60μg的混合对照品溶液。
1.3.3 分子设计模拟
使用 Autodock 4.2进行分子设计模拟，选择流动相中环糊精的种类。α-CD、β-CD、γ-CD 三维立体结构取自剑桥晶体库（https://www.ccdc.cam.ac. uk/），积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B 三维立体结构取自pubchem 网站（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）。客体分子结构中可旋转的单键、非极性氢原子等均依照 Autodock程序默认值。分子对接在立方体格子中进行，其长、宽、高均为 12.6nm，格子间隔为0.0375nm，对接计算采用 Lamarckian遗传算法。使用 LigPlot+ 程序分析复合物中主客体之间作用情况。
1.3.4 BoxBehnken效应面法
以羟基积雪草苷和积雪草苷 B 的分离度为指标，根据 BoxBehnken试验设计原理，选取γ-CD 浓度（A，mmol/L）、有机相比例（B，%）以及磷酸浓度（C，%）为自变量，因素与水平见表1。然后以羟基积雪草苷和积雪草苷 B 的分离度为因变量，采用 Design-Expert 13 软件对试验设计结果进行二次多项式拟合，得 3 个因素与响应值（Y）的数学模型。最后，采用 Design-Expert 13软件，依据所拟合的模型，绘制不同因素间的效应面图。
表1BoxBehnken试验设计因素与水平
Table1The factors and levels of BoxBehnken experimental design
1.3.5 色谱条件
采用CAPCELL PAK C18（150mm×4.6mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-环糊精溶液为流动相，流速1.0 mL/min，柱温25℃，检测波长205nm，进样量10μL。
2 结果与分析
2.1 分子设计模拟
羟基积雪草苷和积雪草苷B分子较大，而α-CD 的空腔较小，因此羟基积雪草苷和积雪草苷 B分子不能进入α-CD的空腔而形成包合物。羟基积雪草苷和积雪草苷 B分别与β-CD 和γ-CD 分子设计模拟图见图1。在β-CD模拟图中，羟基积雪草苷的甾体部分全部嵌入β-CD 空腔中，寡糖部分与环糊精形成氢键; 而积雪草苷 B没有嵌入β-CD 空腔中，但寡糖和甾体部分可与环糊精形成氢键（图1，A、B）。在γ-CD模拟图中，羟基积雪草苷的整个分子嵌入 γ-CD空腔中，寡糖部分与环糊精形成氢键; 积雪草苷 B全部甾体和部分寡糖嵌入γ-CD 空腔中，寡糖和甾体部分与环糊精形成氢键（图1，C、D）。分析可知，羟基积雪草苷和积雪草苷 B 均能与γ-CD 形成包合物; 积雪草苷 B 与γ-CD 的氢键作用强于羟基积雪草苷。因此，可选择 γ-CD 作为流动相添加剂。
2.2 BoxBehnken效应面法
2.2.1 BoxBehnken试验结果
依据3因素3水平的 BoxBehnken设计，共进行17次试验，试验色谱条件参数γ-CD浓度（A）、有机相比例（B）和磷酸浓度（C）见表1和表2，每次试验响应值（羟基积雪草苷和积雪草苷 B 的分离度）见表2。其中，羟基积雪草苷和积雪草苷 B 的分离度以试验2最高（4.35），相应的试验色谱条件参数 γ-CD浓度为3mmol/L，有机相比例为20%，磷酸浓度为0.2%。
图1羟基积雪草苷和积雪草苷 B与β-CD（A、B）和 γ-CD（C、D）分子设计对接图
Fig.1The molecular design docking diagram of madecassoside or asiaticoside B with β-CD (A, B) and γ-CD (C, D)
A、C.羟基积雪草苷；B、D.积雪草苷B。
A, C. Madecassoside. B, D. Asiaticoside B.
表2BoxBehnken试验设计与结果
Table2BoxBehnken experimental design and results
2.2.2 模型拟合
采用 Design-Expert 13软件对表2的结果进行二次多项式拟合，得到3个因素（A、B、C）与响应值（Y）的数学模型:Y=3.06+0.9075A-0.6125B-0.1225C+0.0850AB-0.0550AC-0.0150BC-0.2660A 2+0.1990B 2-0.0910C 2。该数学模型（P <0.0001，R 2>0.9）具有较高的可信度，可用于流动相最佳参数的预测。在数学模型中，各自变量的方差分析结果（表3）表明，A 和B 的一次项达到极显著水平（P<0.0001），A 的二次项达到显著水平（P<0.05），其他项均不显著。
2.2.3 效应面分析
采用Design-Expert 13软件，依据所拟合的模型，绘制不同因素间的效应面图（图2）。随着γ-CD浓度增大，羟基积雪草苷和积雪草苷 B的分离度逐渐增加，但是增加幅度逐渐减小; 随着有机相乙腈浓度增加，羟基积雪草苷和积雪草苷B的分离度逐渐减小; 磷酸浓度对羟基积雪草苷和积雪草苷B的分离度几乎没有影响。因此，优化的色谱条件为流动相为乙腈-3 mmol/L γ-CD溶液（含0.10%磷酸）=20∶80（V/V）。
表3数学模型中各自变量的方差分析
Table3Variance analysis of individual variables in mathematical models
图2γ-CD浓度、有机相比例、磷酸浓度相互作用对羟基积雪草苷和积雪草苷 B的分离度影响的三维效应面图
Fig.2Three dimensional response surface diagram of the interaction between γ-CD concentration, organic phase ratio, and phosphate concentration on the resolution of madecassoside or asiaticoside B
2.2.4 效应面预测与验证
依据数学模型，在优化的色谱条件下，羟基积雪草苷和积雪草苷 B 分离度的预测值为4.43。按上述选化的色谱条件，重复进样分析混合对照品溶液 3次。羟基积雪草苷和积雪草苷 B的色谱分析见图3，羟基积雪草苷和积雪草苷 B的分离度为4.32，相对标准偏差（RSD）为1.20%（n=3），与预测值相对误差为2.48%。
图3不同产地积雪草药材的 HPLC色谱图
Fig.3HPLC chromatograms of medicinal herbs of C. asiatica (L.) Urban from different regions
A. 混合对照品；B.江苏产积雪草; C.云南产积雪草; D.陕西产积雪草；1. 积雪草苷；2. 积雪草苷B；3.羟基积雪草苷。
A. Standard mixture. B. C. asiatica from Jiangsu. C. C. asiatica from Yunnan.D. C. asiatica from Shaanxi.1, asiaticoside.2, asiaticoside B.3, madecassoside.
2.3 方法学验证
2.3.1 系统适用性试验
精密量取积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B混合对照品溶液，及供试品溶液各10μL，按优化后的色谱条件进样分析，记录色图谱。结果（图3）显示，积雪草供试品溶液色谱图中在与混合对照品溶液色谱图相应的位置上有相同的色谱峰，积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B色谱峰达到基线分离，其中羟基积雪草苷和积雪草苷B的分离度为4.32。
2.3.2 线性考察
精密量取1.3.2节混合对照品溶液2，4，8，12，16，20μL，按优化后的色谱条件进样分析，记录色谱图及峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），进样量（X，ng）为横坐标，绘制标准曲线。结果显示，积雪草苷为200~2000ng、积雪草苷B为120~1200ng、羟基积雪草苷为200~2000ng内线性关系良好，线性方程分别为Y=5729.5X-748.6（r=0.9999）、 Y=4627.2X-493.4（r=0.9997）和Y=7114.6X-586.5（r=0.9999）。
2.3.3 精密度试验
按优化后的色谱条件，精密量取1.3.2节混合对照品溶液重复进样6次，测定积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B色谱峰面积。结果显示，积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B三者峰面积的 RSD 均小于1.65%，精密度良好。
2.3.4 重现性试验
精密称取同一批积雪草药材5份，按1.3.1节方法制备5份供试品溶液，按优化后的色谱条件进样分析，记录积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B 的峰面积，并计算三者含量。结果显示，积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B的含量分别为（3.35± 0.11）mg/g、（3.84±0.09）mg/g和（3.67±0.08）mg/g，RSD均小于2.02%，重现性良好。
2.3.5 稳定性试验
精密量取1.3.1节的供试品溶液，分别于0，2，4，6，8h分别进样10μL，记录积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B 的峰面积，计算 RSD。结果显示，积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B 的峰面积 RSD均小于1.62%，二者在8h内稳定。
2.3.6 回收率试验
精密称取积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B含量分别为3.35mg/g、3.84mg/g和3.67mg/g 的积雪草药材0.5g，加入1.3.2节2.0mL混合对照品储备液，按1.3.1节方法制备供试溶液，然后按优化后的色谱条件进样分析，计算加样回收率。结果显示，积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B 三者的平均回收率分别为 99.0%（RSD=2.17%）、 98.2%（RSD=2.30%）和98.7%（RSD=2.11%），回收率良好。
2.4 样品测定
取不同产地的积雪草药材，按1.3.1节方法制备供试品溶液，按1.3.5节方法和优化后的色谱条件进样分析，计算药材中积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B含量。结果（表4）显示，江苏产样品中积雪草苷含量最低，羟基积雪草苷和积雪草苷 B含量均最高; 云南产样品中积雪草苷含量最高，羟基积雪草苷和积雪草苷 B含量均最低; 陕西产样品中各成分含量均处于中等。
表4不同产地积雪草药材中积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B含量（n=3）
Table4The content of asiaticoside, asiaticoside B, and madecassoside in C. asiatica (L.) Urban from different regions (n=3)
3 讨论
积雪草的主要活性成分是三萜类化合物，包括积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草苷 B、积雪草酸和羟基积雪草酸等。现有研究主要通过 HPLC 法测定积雪草药材中积雪草苷或积雪草苷和羟基积雪草苷的含量，并不能完全反映积雪草药材的质量[11-13]。羟基积雪草苷和积雪草苷 B 为同分异构体，常规 C18 色谱柱不能进行有效地分离。邹准等[14]采用 C30 色谱柱分离羟基积雪草苷和积雪草苷 B，但是二者仅仅达到基线分离，且分离时间较长。本研究采用环糊精为流动相添加剂的高效液相色谱法，分离测定积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B，不仅分离效果较好，而且时间较短，能更全面的检测积雪草药材的质量。
环糊精是葡萄糖单元以 1，4-糖苷键结合而成的低聚糖，具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构[15]; 其空腔内由于受到 C-H 键的屏蔽作用形成疏水区，可以包合各种适当的客体[16]。羟基积雪草苷和积雪草苷 B分子与α-CD 和β-CD 内部空腔不匹配，不能形成稳定的包合物。γ-CD 内部空腔较大，羟基积雪草苷和积雪草苷 B的疏水部分-甾体部分可以进入γ-CD 内部空腔，形成稳定的包合物。在γ-CD与羟基积雪草苷和积雪草苷 B形成的包合物中，羟基积雪草苷的寡糖部分与γ-CD 形成氢键，而积雪草苷 B 的寡糖和甾体部分均可与环糊精形成氢键，因此γ-CD 与积雪草苷 B 的包合作用强于 γ-CD与羟基积雪草苷的包合作用。
在反相液相色谱中，环糊精作为流动相添加剂，通过包合作用或分子间作用（如氢键作用）减弱分析物在固定相上保留，不仅使分析物的保留时间大幅度降低，还可改善同分异构体的分离，甚至用于拆分手性对映体[17-18]。γ-CD 内部空腔与羟基积雪草苷和积雪草苷B分子大小匹配，均能形成包合物。但由于积雪草苷 B与γ-CD的包合作用强于羟基积雪草苷，因此积雪草苷 B在色谱柱上先被洗脱掉，保留时间较小，色谱峰位于羟基积雪草苷之前。
BoxBehnken效应面法优化结果显示，随着有机相乙腈比例的增加，羟基积雪草苷和积雪草苷 B 的分离度逐渐变小。其原因是有机相乙腈的增加不仅使羟基积雪草苷和积雪草苷 B 在固定相上保留时间减少，从而导致二者与γ-CD 之间作用时间变短，而且不利于包合作用。若有机相乙腈用量过小，羟基积雪草苷和积雪草苷 B 在固定相上的保留时间过长，会造成二者色谱峰扩散严重。
4 结论
研究采用分子设计和效应面法优化得到的 HPLC 色谱条件为:CAPCELL PAK C18 柱（150mm×4.6 mm，5μm），流动相为乙腈-3 mmol/Lγ-环湖精溶液（含 0.10% 磷酸）=20∶80（V/V），流速为 1.0 mL/min，柱温为25℃，检测波长为205nm。该方法可简单快速分离并测定积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B 的含量，结果准确可靠，可作为积雪草药材中主要三萜类化合物的测定方法。
