摘要
【目的】克隆红肉火龙果果糖激酶基因,检测其表达和酶活性,解析其对果实发育可溶性糖积累的生理功能。【方法】从‘紫红龙’果肉克隆 HpFRK1 基因,进行生物信息学和亚细胞定位分析,利用qRT-PCR 检测基因表达,通过大肠杆菌诱导表达获得重组蛋白并检测酶活性。【结果】HpFRK1 的开放阅读框长度为993bp,编码330 个氨基酸,具有磷酸果糖激酶 B 家族结构域。HpFRK1 与甜菜 BvFRK 亲缘关系最近,均属于细胞质定位的 FRKs。HpFRK1 在成熟茎和不同发育时期果实均表达,在花后20d的果实表达量最高,随果实发育逐渐下调,花后30d(果实成熟)表达量最低。亚细胞定位检测表明 HpFRK1主要定位于细胞核和细胞质。诱导获得的 HpFRK1重组蛋白特异性催化果糖磷酸化(Km 为11.01mmol/L)。【结论】HpFRK1在细胞质特异性催化果糖磷酸化,在红肉火龙果果实发育期间负调控果实可溶性糖积累。
Abstract
[Objective] The study aims to clone the fructokinase (FRK) gene of red pitaya (Hylocereus polyrhizus), detect its expression and enzyme activity, and analyze its physiological function in soluble sugar accumulation during fruit development. [Methods] HpFRK1 gene was cloned from ‘Zihonglong’ fruits, and bioinformatics and subcellular localization analysis were carried out. Gene expression was detected by qRT-PCR. Recombinant protein was obtained by E.coli induction and enzyme activity was detected. [Results] The open reading frame (ORF) of HpFRK1 was 993 bp in length, encoding 330 amino acids with a phosphofructokinase type B (pfkB) domain. HpFRK1 had the closest genetic relationship with sugar beet BvFRK, both of which belonged to cytoplasm localized FRKs. HpFRK1 was expressed in different developmental stages of mature stems and fruits. The expression level of HpFRK1 was the highest at 20 days after flowering and the lowest at 30 days after flowering (fruit ripening), and was gradually decreased with fruit development. Subcellular localization assay showed that HpFRK1 was mainly localized in the nucleus and cytoplasm. HpFRK1 recombinant protein specifically catalyzed fructose phosphorylation (Km=11.01 mmol/L). [Conclusion] HpFRK1 specifically catalyzes fructose phosphorylation in the cytoplasm and negatively regulates fruit soluble sugar accumulation during the development of red-fleshed pitaya fruits.
Keywords
植物光合产物主要以蔗糖的形式存在和运输，蔗糖经蔗糖合成酶和转化酶分解成己糖（葡萄糖和果糖）; 己糖在己糖激酶（hexokinase，HXK）和果糖激酶（fructokinase，FRK）的磷酸化作用下生成己糖-6-磷酸，为植物的生长发育提供碳骨架、能量和信号[1]。FRK 和 HXK 均可催化果糖磷酸化，但 FRK 对果糖的亲和力大于 HXK，表明 FRK 是果糖磷酸化的关键酶[2]。果糖经 FRK 磷酸化作用后可进入糖酵解途径、磷酸戊糖途径和淀粉合成。此外，FRK 作为糖信号感受器，参与调控维管发育、花粉发育和开花期等，在植物的生长发育过程中扮演着重要角色[3]。
植物FRK 基因编码的蛋白属于 pfkB 碳水化合物激酶家族，其氨基酸序列含有高度保守的 ATP 和糖结合域[4]。FRKs常以多基因家族形式存在于植物中。目前，番茄已鉴定出4个 FRKs 基因，其中SlFRK1 在果实幼果期的表达量低，随果实生长发育逐渐上调; SlFRK2 仅在果实发育初期高度表达，在成熟叶片中几乎不表达; SlFRK3 在大部分组织中均表达; SlFRK4 在雄蕊中特异表达[5-7]。Li 等[8]从苹果中分离出 4 个 FRKs，其中，MdFRK1 和MdFRK2 在茎尖中的表达量高于成熟叶片，而 MdFRK2、MdFRK3 和MdFRK4 仅在果实发育初期表达。此外，FRKs在拟南芥[9-10]、枇杷[11]、梨[12]、水稻[13]、甘蔗[14]、杧果[15]和黄瓜[16]等植物中相继得到分离鉴定。
植物 FRK 蛋白主要存在于细胞质和质体，如番茄SlFRK1、SlFRK2 和 SlFRK4 位于细胞质，而 SlFRK3则位于质体，亚细胞定位的差异性反映出其在不同亚细胞器中发挥特定功能[17]。FRK 的催化活性受外界环境、组织差异性和 pH 值等因素影响。FRK对 ATP 具有更高的亲和力，外源添加 Mg2+ 会刺激其催化活性，从而为细胞的糖运输提供信号[10]。此外，FRK 的催化抑制活性在不同的同工酶之间存在差异[18]。园艺植物果糖激酶基因的表达与果实可溶性糖积累显著相关。研究表明，苹果 MdFRK2 和柑橘CuFRK2 在果实发育早期高表达，在成熟后期转录水平下降，与果糖积累呈负相关[19-20]。杨梅 MrFPK2 在果实发育早期大量表达，在成熟后期表达量下降，并参与降解果实果糖含量[21]。梨PpyFRK5 随果实发育下调表达，能促进果实糖含量的增加[12]。这些结果表明，FRK 参与调控园艺植物果实的可溶性糖积累。
红肉火龙果（Hylocereus polyrhizus）属于仙人掌科（Cactaceae）量天尺属（Hylocereus）多年生木本果树，其果肉色泽鲜艳、酸甜可口，富含可溶性糖、有机酸、氨基酸、维生素、黄酮和甜菜色素等营养成分，深受消费者喜爱[22]。研究表明，红肉火龙果果实可溶性糖（蔗糖、果糖和葡萄糖）的组成和占比随果实发育而相应变化[23]。阐明FRK 在红肉火龙果果实发育期间可溶性糖积累的分子机制，对提高果实品质具有重要意义。目前，鲜见红肉火龙果FRK 参与介导果实发育过程中可溶性糖积累相关的研究。本研究基于前期红肉火龙果不同发育时期果实的转录组测序数据，筛选并克隆 FRK 相关基因 HpFRK1，对其进行生物信息学、基因表达、蛋白亚细胞定位和重组蛋白酶学活性等分析，阐明其在红肉火龙果果实发育过程中的作用机制，以期为提高红肉火龙果果实风味和品质提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试材料为红肉火龙果品种 ‘紫红龙’（H. polyrhizus cv.‘Zihonglong’），种植于贵州省镇宁县火龙果种植园。选择长势一致的3株结果植株，分别采集成熟茎以及开花后不同发育时期（花后20d、23 d、25d、27d、30d）的果实，每个时期采15个果实。液氮冷冻后保存于-80℃条件下，用于后续试验。
1.2 试验方法
1.2.1 总 RNA提取及cDNA合成
采用北京艾德莱生物科技有限公司 EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit试剂盒（RN53，Aidlab，中国）分别提取红肉火龙果成熟茎和果实总 RNA，使用 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒（6110A，TaKaRa，日本）进行 cDNA 的合成。
1.2.2 基因克隆
基于研究者前期的转录组测序数据，获取红肉火龙果 FRK1 的转录本序列[24]。使用 NCBI数据库 Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/）设计克隆基因特异性引物 HpFRK1-F/R（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分别以红肉火龙果成熟茎和不同发育时期果实cDNA 为模版，参考南京诺维赞生物科技股份有限公司高保真 DNA 聚合酶说明书（P515，Vazyme，中国）进行 PCR 扩增。反应体系体积为 25μL:cDNA2μL，上、下游引物各1μL，高保真酶 12.5μL，ddH2O 8.5μL。PCR 反应程序:95℃预变性3min; 95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸90s，共35个循环; 最后72℃延伸5min，4℃保存，PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用天根生化科技有限公司琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒（DP209-03，天根，中国）进行产物回收、连接并转化至大肠杆菌感受态细胞 DH5α，随机挑选5个阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.2.3 序列分析
使用 ProtParam（https://web.expasy.org/ protparam/）在线分析 HpFRK1蛋白质理化性质; 使用 TMHMM（https://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）进行蛋白跨膜区结构预测; 利用 WOLFPSORT 网址（http://www.csbio.sjtu. edu.cn/bioinf/plant/）在线预测亚细胞定位位置; 利用 DNAMAN 软件进行氨基酸序列的多重比对; 基于 GeneDoc软件可视化分析蛋白序列结构域; 使用 MEGA7.0 软件基于邻接法（neighbor-joining method）创建系统进化树，自展值（bootstrap）设置为1000次。
1.2.4 基因表达分析
使用 NCBI数据库 Primer-BLAST（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计目的基因 qRT-PCR 引物 HpFRK1-qRT-F/R，内参基因使用 β-ACT-F/R（表1）。使用荧光定量 PCR仪（CFX96，BIO-RAD，美国）进行 PCR 反应，参照百迈客生物科技有限公司荧光定量说明书（RK02001，Biomarker，中国）进行 qRT-PCR 反应，反应体系体积为20.0μL:cDNA1μL，上、下游引物各0.4μL，2×SYBR Green Fast qPCR Mix试剂 10μL，无菌水 8.2μL。反应程序:95℃ 预变性 3 min; 95℃变性5s，60℃延伸30s，40个循环。每个反应设置3次技术重复，采用计算目的基因的相对表达量。
1.2.5 亚细胞定位
以克隆正确的 HpFRK1 完整 CDS 序列为模版，使用引物 HpFRK1-GFP-F/R（表1）扩增并回收产物; 使用南京诺维赞生物科技股份有限公司单片段无缝克隆试剂盒（C112，Vazyme，中国）将目的片段与载体连接，将重组载体 pC1300-HpFRK1-GFP转化至大肠杆菌感受态细胞 DH5α，涂板，并随机挑选5个阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
表1引物序列信息
Table1Information of primer sequences
将构建好的载体质粒 pC1300-HpFRK1-GFP 和空载体 pC1300-GFP 分别转入农杆菌 GV3101，28℃培养 2d，收集菌体并重悬菌体（重悬液:10 mmol/L MgCl2，120μmol/L 乙酰丁香酮），OD600 为0.6，室温静置3h。将含有目的基因载体和空载体的农杆菌菌液分别注射到烟草叶片，弱光培养2 d，使用激光共聚焦显微镜（A1HD25，Nikon，日本）观察荧光蛋白分布并拍照。
1.2.6 原核表达
HpFRK1 的 CDS在大肠杆菌表达的密码子优化及优化后的基因合成，委托安徽环球基因科技有限公司进行。将优化合成的基因片段连接至原核表达载体pGEX-4T-1，并转化至大肠杆菌感受态细胞 BL21（DE3）中，涂板后37℃倒置培养过夜; 挑选单个菌落接种于含有抗生素的 LB培养基中，37℃下 200r/min培养至菌体 OD600 为0.6~0.8时，加入 0.5mmol/LIPTG 诱导表达。收集菌体超声波破碎，利用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
1.2.7 重组蛋白酶活性检测
参考 Yang等的方法[19]，对 HpFRK1重组蛋白的酶活性进行测定。反应体系体积为 1 mL:2.5 mmol/LATP（A8270，Solarbio，中国）、0.33mmol/L NAD +（N8110，Solarbio，中国）、1U 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G8020，Solarbio，中国）、1U 磷酸葡萄糖异构酶（S10079，源叶生物，中国）、50 mmol/L TrisHCl缓冲液（pH8.0）和 4 mmol/L MgCl2，25μL 重组蛋白，最后加200μL不同浓度（0~80mmol/L）的底物。将上述反应体系混匀后立即在30℃条件下水浴5min，以沸水失活的重组蛋白为空白对照，于340nm 处检测待测样品吸光值 A340。酶活性定义:1U 即1min内1.0mg重组蛋白的 A340 值增加0.01。
2 结果与分析
2.1 HpHXK 基因克隆与生物信息学分析
以‘紫红龙’果实的果肉 cDNA 为模板，经过 RT-PCR 和测序获得 HpFRK1，该基因 ORF 为 993bp，编码330个氨基酸。蛋白理化性质结果表明，HpFRK1蛋白相对分子质量为35.52kD，共包括5026个原子，分子式为 C1585H2528N424O478S11，理论等电点为5.20。氨基酸种类组成结果表明，HpFRK1蛋白丙氨酸含量最多，为38个，占比11.5%。 HpFRK1蛋白不稳定系数为22.39，属于稳定性蛋白; 脂肪指数为97.00，以上结果说明该蛋白为脂溶性稳定蛋白质。蛋白跨膜结构预测结果表明 HpFRK1蛋白不含有跨膜区，不属于膜蛋白。
序列比对（图1）表明，HpFRK1蛋白具有pfkB 碳水化合物激酶家族高度保守结构域，包括2个底物结合位点、1个 ATP 结合位点和2个 pfkB 家族特异性区域。系统进化分析（图2）表明，红肉火龙果 HpFRK1与甜菜 BvFRK 亲缘关系最近。此外，HpFRK1与定位于细胞质的拟南芥 AtFRK2、AtFRK4-7、梨PpyFRK5、甜菜BvFRK、木薯 MeFRK5 和番茄SlFRK2聚为一类。
图1HpFRK1与其他 FRKs氨基酸序列分析
Fig.1Amino acid sequence analysis of HpFRK1 and other FRKs
其他FRKs：AtFRK1（At5g51830）、AtFRK2（At2g31390）、SlFRK1（AAB57733.1）和SlFRK2（AAB57734.1）。
Other FRKs: AtFRK1 (At5g51830) , AtFRK2 (At2g31390) , SlFRK1 (AAB57733.1) , and SlFRK2 (AAB57734.1) .
图2HpFRK1与其他 FRKs的系统进化分析
Fig.2Phylogenetic analysis of HpFRK1 and other FRKs
2.2 HpFRK1蛋白的亚细胞定位
在烟草叶肉细胞的亚细胞定位显微观察表明，载体对照1300-GFP主要在细胞核和细胞质检测到绿色荧光信号; HpFRK1-GFP 融合蛋白也主要在细胞核和细胞质检测到绿色荧光信号，且未与叶绿体自发荧光重叠。因此，亚细胞定位检测表明 HpFRK1蛋白主要位于细胞核和细胞质（图3）。
2.3 HpFRK1 在不同组织中的表达分析
荧光定量 PCR 检测（图4）表明，HpFRK1 基因在成熟茎和不同发育时期果实均表达。其中，HpFRK1 基因的表达量在花后20d的果实最高，显著高于花后25d、27d、30d的果实和茎的表达量，在花后30d（果实成熟时）表达量最低。结果表明，HpFRK1 基因随果实的发育而逐渐下调表达。
图3HpFRK1蛋白的亚细胞定位
Fig.3Subcellular localization of the HpFRK1 protein
图4HpFRK1 基因在红肉火龙果茎和果实的表达模式
Fig.4Expression patterns of the HpFRK1 gene in stems and fruits of red pitaya
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
Different lowercase letters represent significant differences (P＜0.05) .
2.4 HpFRK1原核表达
SDS-PAGE检测结果（图5）表明，HpFRK1重组蛋白成功在大肠杆菌诱导表达。与对照（1）相比，经IPTG 诱导的 HpFRK1重组蛋白特异条带介于 45~66.2kD，靠近66.2kD，该条带包含 His标签蛋白27kD。因此，HpFRK1蛋白实际大小与理论预期蛋白大小一致，表明原核表达后成功诱导获得 HpFRK1重组蛋白。
图5HpFRK1 原核表达产物的SDS-PAGE检测
Fig.5SDS-PAGE detection of HpFRK1 expression products
M.蛋白分子质量标准；1.未诱导样品；2.诱导后样品。
M, protein marker.1, uninduced sample.2, induced sample.
2.5 HpFRK1重组蛋白的酶学性质
HpFRK1重组蛋白对不同底物的酶催化活性检测（图6，A）表明，其仅对果糖具有催化活性，对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、甘露糖和半乳糖底物均无催化活性。酶动力学特性分析（图6，B）表明，当果糖浓度小于20mmol/L 时，HpFRK1重组蛋白的酶催化活性随果糖浓度增加表现快速增加的趋势; 当果糖浓度超过20 mmol/L 时，酶催化活性随果糖浓度增加表现缓慢增加的趋势，且未表现高浓度底物对酶活性的抑制。通过 Michaelis-Menten方程计算，HpFRK1重组蛋白催化果糖磷酸化的 Km 值为11.01mmol/L。
图6HpFRK1重组蛋白的酶活性分析
Fig.6Enzyme activity assay of the HpFRK1 recombinant protein
A图中所用底物浓度均为200 mmol/L；**表示P＜0.01。
The substrate concentrations used in A were 200 mmol/L. ** indicates P＜0.01.
3 讨论
本研究基于红肉火龙果果实转录组测序获得的 FRK相关序列，通过 RT-PCR 克隆 HpFRK1 基因。 HpFRK1蛋白具有 pfkB 家族特征结构域，包括 ATP结合位点和糖结合域。系统进化分析表明，HpFRK1与拟南芥和番茄 FRKs聚为一类，与甜菜 BvFRK 亲缘关系最近。因此，HpFRK1 是红肉火龙果果糖激酶的关键编码蛋白之一，可能参与果实发育期间的果糖代谢。研究表明，植物的 FRK 蛋白主要分布于细胞质和质体[3]。目前，拟南芥和番茄分别报道了7个和4个 FRK 基因，仅拟南芥 AtFRK3和番茄 SlFRK3位于质体，其余均定位于细胞质[9-10，17]。木薯 MeFRK2、MeFRK5和 MeFRK6位于细胞质，MeFRK1 则定位于质体[25]; 梨 PpyFRK5和苹果 MdFRK1定位于细胞质[12，19]。红肉火龙果 HpFRK1 与定位于细胞质的拟南芥 AtFRK2、AtFRK4-7、番茄 SlFRK2、梨 PpyFRK5、甜菜 BvFRK 和木薯 MeFRK5聚为一类，与定位于质体的拟南芥 AtFRK3、番茄 SlFRK3 和木薯 MeFRK1明显分开，推测 HpFRK1 可能定位于细胞质。进一步通过亚细胞定位实验验证，红肉火龙果 HpFRK1分布于烟草叶肉细胞的细胞质和细胞核，未见分布于质体。
植物 FRK 蛋白催化的底物类型与 HXK 存在明显差异，通常表现高度的底物特异性[26]。例如，拟南芥 AtFRK1 和 AtFRK2、苹果 MdFRK1 和 MdFRK2、玉米 ZmFRK1和 ZmFRK2对果糖具有高度的底物特异性[9，19，27]。本研究鉴定的红肉火龙果 HpFRK1对蔗糖、葡萄糖、甘露醇、甘露糖、半乳糖、山梨醇和麦芽糖均无催化活性，仅对果糖具有催化活性，与 FRK 底物特异性高度一致。同时，拟南芥 AtFRK1不受果糖抑制，而 AtFRK2、AtFRK3、 AtFRK4、AtFRK5 和 AtFRK6 受高浓度果糖抑制[10]; 番茄 SlFRK1 对果糖的底物抑制特性不明显，而SlFRK2对果糖的抑制表现灵敏[6]; 水稻 OsFRKⅠ不具有底物抑制性，而 OsFRKⅡ活性受高浓度果糖抑制[28]。然而，苹果 MdFRK1 和 MdFRK2的催化活性均受高浓度果糖抑制[19]。本研究鉴定的红肉火龙果 HpFRK1对果糖不具有抑制性，推测其与番茄SlFRK1、拟南芥 AtFRK1和水稻 OsFRKⅠ酶学特性类似。红肉火龙果 HpFRK1磷酸化果糖的 Km 值（11.01mmol/L）远高于番茄SlFRK1（1.3mmol/L）、番茄SlFRK2（0.054mmol/L）、苹果 MdFRK1（0.62 mmol/L）和苹果 MdFRK2（0.1mmol/L）[5-6，19]，说明 HpFRK1对果糖的亲和力较低，与上述 FRK 的酶催化活性存在差异。
园艺植物果实发育期间，FRK 的表达与果实可溶性糖积累呈现负相关关系[11，20-21]。例如，枇杷 EjFRK [11]、梨PpyFRK5 [12]、苹果MdFRK2 [19]、柑橘 CuFRK2 [20]、杨梅 MrFPK2 [21]和枸杞LbFRK7 [29]在果实发育早期高表达，果实成熟后期，FRK 基因低表达有利于果实可溶性糖积累。本研究结果表明，HpFRK1 基因的表达与红肉火龙果果实发育期间可溶性糖积累呈负相关，与前人研究结果一致。红肉火龙果果实发育早期，果实可溶性糖含量和组成变化较小。果实转色期（20d）至成熟期（30d），HpFRK1 基因的表达显著下调，相应的以果糖和葡萄糖为主的可溶性糖含量迅速累积，于果实成熟时达到最大值。因此推测，HpFRK1 参与介导红肉火龙果果实发育期间的果糖代谢途径，负调控果实的可溶性糖积累。
4 结论
（1）从红肉火龙果 ‘紫红龙’果实的果肉克隆 HpFRK1，其 ORF长度为993bp，编码330个氨基酸，HpFRK1蛋白相对分子质量为35.52kD，理论等电点为5.20。
（2）HpFRK1蛋白具有pfkB家族特征结构域，与甜菜 BvFRK 亲缘关系最近，主要定位于细胞核和细胞质，并特异性催化果糖磷酸化，其 Km 值为 11.01mmol/L。
（3）红肉火龙果果实发育期间，HpFRK1 在花后20d的果实表达量最高，并随着果实发育而逐渐下调表达，负向调控果实可溶性糖积累。
