摘要
【目的】 ABA是植物干旱胁迫的关键激素，通过代谢组学分析揭示旱柳离体枝条ABA介导的失水响应差异代谢物及其相关通路，为旱柳干旱胁迫响应提供研究基础和理论依据。【方法】以旱柳离体枝条为材料，探究ABA合成抑制剂钨酸钠溶液浸泡后旱柳失水至不同水势枝条木质部代谢组的差异响应。【结果】失水至P50(-1.9 MPa)旱柳枝条代谢组与未失水枝条相比，内源ABA含量显著增加了425.032%，D-果糖等可溶性糖含量与L-谷氨酸等氨基酸含量显著增加。ABA抑制剂处理后内源ABA含量显著降低了79.253%，D-1,5-脱水果糖等可溶性糖含量与苯丙氨酸等氨基酸含量显著降低。植物激素信号转导、类胡萝卜素生物合成和淀粉与蔗糖代谢途径等是旱柳枝条失水响应的关键代谢通路。【结论】旱柳枝条失水后ABA含量显著增加，介导多糖水解过程等降低了细胞渗透势以应对干旱胁迫。
Abstract
[Objective] ABA is a key hormone for drought stress in plants. Differential metabolites and their associated pathways of ABA-mediated dehydration response in the isolated branches of Salix matsudana were investigated by metabolomics analysis, which provided the basis for the response to drought stress in S. matsudana. [Methods] The authors investigated the differential response of the xylem metabolomes of the S. matsudana branches dehydrated to different water potentials after soaked in the sodium tungstate solution, an inhibitor of ABA synthesis, using the isolated branches of S. matsudana as materials. [Results] Compared with the deionized water-soaked non-dehydrated branches, in the dehydrated to the P50 water potential branches the endogenous ABA content was significantly increased by 425.032%, and content of the soluble sugars such as D-fructose was significantly increased along with the content of amino acids such as L-glutamic acid. When ABA synthesis inhibitor-soaked branches was compared to deionized water-soaked branches, the content of endogenous ABA was significantly decreased by 79.253%, and the content of the soluble sugars such as D-1, 5-defructose and amino acids such as phenylalanine were significantly reduced after soaked in the inhibitor of ABA synthesis. Plant hormone signal transduction, carotenoid biosynthesis and starch and sucrose metabolism pathways were the key pathways in the dehydrated response of S. matsudana branches. [Conclusion] In the S. matsudana branches after dehydration, the ABA content is increased significantly, mediating the polysaccharide hydrolysis process and other processes to reduce the osmotic potential in response to drought stress.
Keywords
由于气候变化，干旱发生频率、持续时间和严重程度在全球范围内均有显著增加[1]。植物受干旱胁迫较轻时可通过气孔关闭等减少水分蒸发[2]。在强烈和长期干旱的条件下，植物木质部负压超过一定阈值时，空气种子侵入功能导管，迅速膨胀并充满整个管腔，阻碍导管的水分运输，最终形成栓塞[3]。栓塞降低了木质部液压系统向树冠输送水的能力，并可能导致树冠枯死和整个植物死亡[4-5]。植物木质部栓塞是导致全球干旱条件下树木死亡和森林衰退的主要因素。
植物的水分利用效率是其适应极限环境条件的关键因素之一，这意味着植物需要有效地协调碳同化和水分耗散之间的关系，以确保其生存[6]。植物干旱胁迫响应代表了一个复杂且高度动态变化的过程，植物激素是植物响应干旱胁迫的重要调节因子，其中脱落酸（ABA）被认为是植物适应干旱胁迫的关键激素之一。已有研究表明，ABA是干旱胁迫后的主要长距离化学信号，可在叶子和根部合成，它可以通过木质部和韧皮部在植物中快速运输[7]。在干旱胁迫期间，ABA含量上调[8]，并被证明是多种与胁迫相关的植物反应的原因，如渗透调节、离子运输和气孔关闭等[9]。
目前，关于干旱胁迫后植物的相应响应机制尚不明确。代谢组学以其先进的分析技术和强大的数据库资源，可全面定性和定量分析特定生物系统中所有代谢物的时间和空间分布，已被广泛应用于植物学等领域。植物在干旱逆境条件下的一系列复杂的响应机制，包括激素诱导、渗透调节、离子通道激活、碳水化合物代谢等[10-11]。这些过程涉及蛋白质和其他小分子代谢物等，可直接参与植物细胞结构和新陈代谢，起着至关重要的作用[12]。因此，干旱胁迫下对植物进行代谢组学分析至关重要，能够更加全面地研究植物对干旱的反应，明确植物在干旱条件下应对失水响应的内部响应机制。
旱柳（Salix matsudana）是中国北方优良的园林树种，研究以旱柳离体枝条为材料，探究ABA合成抑制剂处理后旱柳失水至不同水势枝条木质部中代谢组的响应。通过分析不同处理样品间代谢物的差异及相关关键代谢通路，确定旱柳失水枝条中ABA介导的代谢组响应。研究不仅可在理论上完善和更新对旱柳干旱胁迫响应的认识，还可用于耐旱树种的快速评价及筛选等。
1 材料和方法
1.1 植物材料
2018年从中国林业科学研究院内同一旱柳上取插穗，经无性扦插繁殖，建立了旱柳无性系圃，保存同一基因型旱柳无性系30株。2023年3月取其枝条，剪成长10 cm左右的插穗，扦插至砂子基质的塑料盆内，盆直径为10 cm，高15 cm。扦插苗生长在中国林业科学研究院玻璃温室中，温室温度20~28℃，16 h/8 h的光/暗周期，每2 d浇1次水，每周每盆定期浇200 mL霍格兰氏营养液。
1.2 试验方法
2023年9月清晨（6:00）随机选取生长健壮、无病虫害的长1.5 m左右枝条8根，用湿毛巾包裹后置于黑色塑料袋中快速带入实验室。用去离子水将枝条清洗干净，在水下将距枝条末端20 cm处剪去并擦干水分，平均分组后分别完全浸入去离子水和100 μmol/L ABA合成抑制剂钨酸钠溶液中，在遮光黑暗的条件下浸泡24 h。取出所有枝条，迅速擦干枝条水分，并置于实验室操作台上分别自然失水至-1.5 MPa、-1.7 MPa、-1.9 MPa（旱柳P50，即旱柳枝条导水损失率为50%时的水势，是反映植物在干旱胁迫下木质部栓塞抗性的一个重要指标）水势，未失水枝条为对照。旱柳枝条的水势采用压力室（PMS1505D-EXP，USA）进行测定，测定水势前将枝条置于黑暗条件下30 min，以避免叶片蒸腾作用等影响，确保枝条水势测定的准确性。枝条木质部导管为旱柳运输水分的主要部位，取失水至特定水势的枝条中部10 cm长枝段，除去枝条的皮层和韧皮部，留取木质部用锡箔纸将其包裹，标记后迅速存于液氮罐中，用于代谢组测定。每个处理重复3次，总计24个枝条。
1.3 代谢物提取与检测
代谢物提取：取液氮速冻过的旱柳枝条木质部样品至离心管中，加入研磨珠和提取液进行冷冻研磨后低温超声提取，冷冻静置后离心，取上清液装上机分析。
代谢物检测：样品进行LC-MS分析的仪器为超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱UHPLC-Q Exactive 系统。旱柳失水枝条样品经电喷雾电离，分别采用正、负离子扫描模式采集质谱信号。
样品质控：将质控样品插入待测样品中进行检测，质控样品由所有样品等体积混合而成。
1.4 数据分析
采用软件Progenesis QI v3.0（WatersCorporation，Milford，USA）进行后期处理及相关分析。
2 结果与分析
2.1 代谢产物鉴定
旱柳失水至不同水势枝条中的代谢物鉴定结果如图1所示。依据代谢物的生物学作用，差异代谢物主要包括有机酸、碳水化合物、激素和传递介质、脂质、肽、核酸、维生素和辅酶因子等，其中有机酸和碳水化合物占比最大。有机酸包括丙酸、丁二酸半醛、苹果酸和亚油酸等; 碳水化合物包括单糖（L-半乳糖、D-半乳糖、D-果糖、L-山梨糖、D-木酮糖和 D-葡萄糖醛酸等）和低聚糖（D-麦芽糖和木糖）; 脂质包括二十烷类（亚油酸、山核桃酸等）和磷脂; 肽包括氨基酸和胺。
图1旱柳失水枝条木质部中代谢物分类
Fig.1Classification of metabolites in the xylem of the dehydrated branches of S. matsudana
条形的颜色标识属于代谢物一级分类类别。
Color of the bar indicates the primary metabolite classification category.
2.2 代谢物PLS-DA分析
对旱柳失水至不同水势枝条中的代谢物和质控样品进行偏最小二乘法判别分析，结果（图2）表明，第1主成分解释度为20.9%，第2主成分解释度为12.5%。同一组别样品相距较近，各处理重复性相对较好。
图2旱柳失水枝条木质部中代谢物的偏最小二乘法判别分析
Fig.2PLS-DA of metabolites in the xylem of the dehydrated branches of S. matsudana
椭圆代表不同组别样本的95%的置信区间。CK0.去离子水浸泡，未失水；CK1.去离子水浸泡，-1.5 MPa；CK2.去离子水浸泡，-1.7 MPa；CK3.去离子水浸泡，-1.9 MPa；W0.钨酸钠溶液浸泡，未失水；W1.钨酸钠溶液浸泡，-1.5 MPa；W2.钨酸钠溶液浸泡，-1.7 MPa；W3.钨酸钠溶液浸泡，-1.9 MPa。下同。
Ovals represent 95% confidence interval for the different groups of samples. CK0, soaked in the deionized water, non-dehydrated. CK1, soaked in the deionized water, -1.5 MPa. CK2, soaked in the deionized water, -1.7 MPa. CK3, soaked in the deionized water, -1.9 MPa. W0, soaked in the sodium tungstate solution, non-dehydrated. W1, soaked in the sodium tungstate solution, -1.5 MPa. W2, soaked in the sodium tungstate solution, -1.7 MPa. W3, soaked in the sodium tungstate solution, -1.9 MPa. The same as below.
在去离子水浸泡处理24 h后，失水至-1.5 MPa枝条与未失水枝条木质部样品距离较近，持续失水至-1.7 MPa、-1.9 MPa后，枝条与未失水枝条木质部样品距离逐渐增大，说明旱柳-1.5 MPa枝条失水至P50水势区间内，失水越多，枝条木质部中的代谢物与未失水枝条木质部相差越大，并且-1.9 MPa与未失水枝条木质部中的代谢物差异较大。ABA合成抑制剂浸泡后失水至P50水势木质部与去离子水浸泡失水至P50水势木质部分布在2个象限内，并且相对距离较远，说明2个处理间存在较大差异。
2.3 差异代谢通路分析
旱柳失水至P50水势枝条中的代谢物KEGG通路如图3所示。去离子水浸泡24 h后，失水至P50水势枝条与未失水枝条中的显著性差异通路有81条，主要包括植物激素信号转导、类胡萝卜素生物合成、糖酵解/糖原异生、淀粉和蔗糖代谢、聚酮糖单元生物合成、果糖和甘露糖代谢、戊糖磷酸途径、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、半乳糖代谢等。
ABA抑制剂处理后旱柳失水至P50水势枝条中的代谢物KEGG通路如图4所示。ABA抑制剂和去离子水分别浸泡24 h后，失水至P50水势枝条中的显著性差异通路有82条，主要包括植物激素信号转导、类胡萝卜素生物合成、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、戊糖磷酸途径、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢、光合生物的固碳作用等。
图3旱柳失水至P50水势枝条中的代谢物KEGG通路
Fig.3KEGG pathway of metabolites in the S. matsudana branches dehydrated to P50 water potentials
图4ABA抑制剂处理后旱柳失水至P50水势枝条中的代谢物KEGG通路
Fig.4KEGG pathway of metabolites in branches of S. matsudana dehydrated to P50 water potentials under ABA inhibitor treatment
2.4 代谢产物差异分析
旱柳失水至不同水势枝条木质部中代谢物表达差异如图5所示。去离子水浸泡24 h后，失水至-1.5 MPa枝条与未失水枝条相比，存在338个显著差异代谢物，包括270个含量增加和68个含量降低的代谢物；失水至-1.7 MPa枝条与未失水枝条相比，存在304个显著差异代谢物，包括219个含量增加和85个含量降低的代谢物；失水至-1.9 MPa枝条与未失水枝条相比，存在406个显著差异代谢物，出现了296个含量增加和110个含量降低的代谢物。ABA合成抑制剂浸泡24 h，失水至P50水势枝条与去离子水浸泡枝条相比，存在390个显著差异代谢物，包括159个含量增加和231个含量降低的代谢物。
图5旱柳失水枝条木质部的代谢物表达差异
Fig.5Differences in metabolite expression in the xylem of the S. matsudana dehydrated branches
旱柳失水至P50水势枝条木质部样品代谢物的显著性差异的代谢物如图6所示。去离子水浸泡24 h后，失水至-1.9 MPa枝条代谢物与未失水枝条相比，显著差异表达代谢物有406个，包括296个含量增加和110个含量降低的代谢物。主要包括碳水化合物49个、有机酸65个、氨基酸及其衍生物60个、激素和传递介质6个、核酸17个等。
图6旱柳失水至P50水势枝条木质部代谢物的火山图
Fig.6Volcano plot of metabolites in the xylem of the S. matsudana branches dehydrated to P50 water potentials
每个圆点代表1个代谢物，圆点越大VIP值越大。下同。
Each dot represents a metabolite, and the larger the dot the greater the VIP value. The same as below.
ABA合成抑制剂处理后旱柳失水至P50水势枝条木质部样品的显著性差异最大的20种代谢物如图7所示。ABA合成抑制剂浸泡24 h后，失水至-1.9 MPa水势枝条代谢物与去离子水浸泡枝条相比，显著差异表达代谢物有390个，包括159个含量增加和231个含量降低的代谢物。主要包括碳水化合物38个、有机酸65个、氨基酸及其衍生物69个、激素和传递介质6个、核酸13个等。
ABA合成抑制剂处理后旱柳失水至P50水势枝条木质部样品的差异代谢物分析结果（表1）表明，旱柳失水至P50水势后内源ABA含量上升，右旋糖酐等多糖含量下降，D-果糖、D-木酮糖和L-山梨糖等可溶性糖含量与L-谷氨酸等氨基酸含量上升。ABA合成抑制剂处理后旱柳失水至P50水势枝条中差异代谢物含量均呈现相反趋势。
图7ABA抑制剂浸泡后旱柳失水至P50水势枝条木质部的火山图
Fig.7Volcano plot of metabolites in the xylem of the S. matsudana branches dehydrated to P50 water potentials under ABA inhibitor treatment
表1ABA抑制剂浸泡后旱柳失水枝条代谢物的差异
Table1Difference of metabolites in the xylem of the S. matsudana dehydrated branches under ABA inhibitor treatment
3 讨论
代谢组学可以通过质谱法产生的丰富代谢数据对植物样本中的内源性物质进行全面系统的定性定量分析，通过比对不同处理样品进行差异分析或通路分析，可以反映植物对生物和非生物刺激的反应，是基因型和表型之间的连接纽带[13]，被认为是研究不同植物物种抗逆胁迫的有力工具，为胁迫生物学研究做出了重大贡献[14]。次生代谢物在植物对环境的适应中起重要作用，包括植物防御、保护和信号转导机制等[15]。在干旱胁迫期间，植物响应可能涉及一些重要的代谢途径，如光合作用、糖合成、三羧酸（TCA）循环、糖酵解和激素合成，植物细胞内代谢物也会发生变化，如可溶性糖、有机酸、酚类、氨基酸、脂肪酸、核苷酸、肽、辅助因子和次级代谢物等[16]。这些代谢物中有许多是植物防御系统的重要组成部分。通过代谢组测序技术对ABA合成抑制剂处理后旱柳失水至不同水势枝条中的代谢产物进行检测，差异代谢物主要包括有机酸、碳水化合物、激素和传递介质、肽、核酸、维生素和辅酶因子等，其中碳水化合物、有机酸和氨基酸占比最大。
碳水化合物（可溶性糖或糖衍生物等）的积累在水分胁迫条件下起到渗透保护剂的作用[17]。短期时间内，干旱胁迫下植物葡萄糖等可溶性糖含量增加，以维持细胞渗透势。胡杨（Populus euphratica）在水分胁迫条件下大多数可溶性糖和糖类衍生物含量增加[18]。有机酸在保障植物体内正负电荷平衡、维持细胞pH稳定中发挥重要作用。在干旱胁迫下，可溶性糖的积累进一步伴随着有机酸或化合物（包括异柠檬酸和α-酮戊二酸）含量升高。氨基酸对干旱胁迫具有响应作用。氨基酸可在各种非生物胁迫下积累，作为金属螯合剂、抗氧化防御分子和信号分子等[19-20]。氨基酸也可通过调节细胞内pH值增强植物的抗旱能力。本研究中去离子水浸泡后失水至-1.9 MPa水势枝条中D-果糖、D-木酮糖和L-山梨糖等可溶性糖含量与L-谷氨酸等氨基酸含量显著增加。这与本研究结果一致。
本试验通过对旱柳失水枝条代谢组学分析发现：去离子水浸泡24 h后，失水至P50水势枝条与未失水枝条中的显著性差异通路有81条，主要包括植物激素信号转导、类胡萝卜素生物合成、糖酵解/糖原异生、淀粉和蔗糖代谢、聚酮糖单元生物合成、果糖和甘露糖代谢、戊糖磷酸途径、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、半乳糖代谢等，共存在406个显著差异代谢物，出现296个含量增加和110个含量减少的代谢物。ABA抑制剂和去离子水分别浸泡24 h后，失水至P50水势枝条中的显著性差异通路有82条，主要包括植物激素信号转导、类胡萝卜素生物合成、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、戊糖磷酸途径、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢、光合生物的固碳作用等，共存在390个显著差异代谢物，出现159个含量增加和231个含量减少的代谢物。植物内源激素作为信号分子参与调节植物生长发育过程，其含量变化在植物响应非生物胁迫中发挥重要作用[21]。当受到干旱胁迫时，植物会产生大量的ABA，外部失水刺激被细胞膜上的未知传感器感知，然后通过植物激素信号转导途径等多种信号通路传递信号，触发ABA诱导的下游生理过程，导致干旱胁迫响应基因的表达，从而赋予植物耐旱性[22]。ABA的生物合成和分解代谢率决定ABA积累以及对胁迫的反应强度，在被子植物中类胡萝卜素生物合成途径是ABA合成的主要的途径。类胡萝卜素是一大类天然染料的总称，广泛存在于自然界[23]，类胡萝卜素作为光合复合体的重要组成部分，在植物抵抗干旱胁迫等方面发挥重要作用，是合成植物激素ABA的前体[24]。本研究中，去离子水浸泡24 h后，失水至P50水势旱柳枝条相较于未失水枝条中的代谢物ABA含量显著增加了425.032%。ABA抑制剂浸泡24 h后，失水至P50水势枝条相较于去离子水浸泡24 h后，失水至P50水势旱柳枝条中的代谢物ABA含量显著减少了79.253%。这是因为在类胡萝卜素合成途径中生成的脱落酸醛是合成ABA的前体物质，钨酸钠能抑制脱落醛氧化酶的活性，使脱落酸醛不能转化为ABA[25]。干旱胁迫下植物组织中碳水化合物含量的变化是植物耐受逆境的特点之一[26]，干旱胁迫下多糖水解使植物体内可溶性糖等渗透调节物质含量升高，增加植物体内水分含量，最终达到抗旱的目的。在淀粉与蔗糖代谢途径中，去离子水浸泡后失水至P50水势枝条中右旋糖酐等多糖含量显著减少，而D-果糖、D-木酮糖和L-山梨糖等可溶性糖含量均显著增加。干旱胁迫导致植物体内可溶性糖积累，其主要生理作用是参加渗透调节过程，可溶性糖积累也是反映抗旱性强弱的有效指标之一，这与前人的研究结果一致。
4 结论
以旱柳离体枝条为材料，探究了旱柳失水至不同水势枝条中ABA介导的代谢组差异响应。差异代谢物主要包括碳水化合物、有机酸、激素和传递介质等。植物激素信号转导、类胡萝卜素生物合成和淀粉与蔗糖代谢途径等是ABA介导旱柳枝条失水响应的关键通路。旱柳枝条失水后代谢物内源脱落酸含量显著增加，右旋糖酐等多糖含量显著减少，D-果糖、D-木酮糖和L-山梨糖等可溶性糖含量与L-谷氨酸等氨基酸含量显著增加，ABA通过介导多糖水解等过程降低了细胞的渗透势以应对干旱胁迫。
