摘要
【目的】 TIFY基因在植物生长发育过程中发挥重要的调节作用，对丝瓜TIFY基因家族成员进行鉴定，筛选果实中高表达的成员，并对其进行克隆和组织表达分析，为阐明其生物学功能奠定基础。【方法】通过生物信息学方法对丝瓜TIFY基因家族成员进行鉴定，基于转录组分析筛选果实中高表达的成员，基于RT-PCR技术对其进行克隆，基于qRT-PCR研究其组织表达。【结果】丝瓜基因组中包含17个TIFY基因，不均匀地分布于9条染色体上，CDS序列全长297~1353 bp，可分为4个亚家族；LcTIFY2、LcTIFY7、LcTIFY11和LcTIFY13在丝瓜果实中的表达量显著高于其他成员；克隆了其CDS序列，分别具有3，5，6，2个外显子；上述4个基因均在丝瓜果皮中的表达量最高，此外，LcTIFY7和LcTIFY13在生殖器官中的表达量显著高于营养器官；LcTIFY11在雌花蕾和子房中的表达量显著高于雄花蕾。【结论】丝瓜TIFY家族成员LcTIFY2、LcTIFY7、LcTIFY11和LcTIFY13可能在其生殖生长和果实发育过程中发挥作用。
Abstract
[Objective] TIFY gene are involved in the regulation of growth and development in plants. This experiment involves the identification of the TIFY family members in Luffa cylindrica, selecting the highly expressed members in fruits, and further cloning and investigating their expression patterns in different tissues, in order to provide basis for the functional identification of these genes. [Methods] Bioinformatics methods were used to idenTIFY the TIFY gene family members in L. cylindrica. Transcriptome analysis was performed to screen the highly expressed members in L. cylindrica fruits, followed by cloning genes using RT-PCR. Tissue expression was analyzed using qRT-PCR. [Results] L. cylindrica genome contains 17 TIFY genes, which were unevenly distributed across 9 chromosomes, with CDS lengths ranging from 297 bp to 1353 bp, classifing into four subfamilies. Transcriptome analysis revealed that LcTIFY2, LcTIFY7, LcTIFY11, and LcTIFY13 were highly expressed in L. cylindrica fruits. The CDS sequences of these genes were cloned, comprising 3, 5, 6, and 2 exons, respectively. Tissue expression analysis indicated that all four genes had the highest expression in the peel of L. cylindrica fruits. Additionally, LcTIFY7 and LcTIFY13 showed significantly higher expression in reproductive organs, while LcTIFY11 exhibited significantly higher expression in female flower buds and ovaries. [Conclusion] The TIFY family members LcTIFY2, LcTIFY7, LcTIFY11 and LcTIFY13 may play roles in reproductive growth and fruit development in L. cylindrica.
Keywords
TIFY是植物中特有的一类转录因子家族，最初被称为花序分生组织中表达的锌指蛋白（ZIM），后因其蛋白质序列中含有1个高度保守TIF[F/Y]XG基序而被命名为TIFY家族[1]。根据结构域的组成可将TIFY家族进一步分为4个亚家族：包含TIFY结构域的TIFY亚家族，包含TIFY、CCT和GATA结构域的ZML（ZIM/ZIM-like）亚家族，包含TIFY和JAS结构域的JAZ（jasmonate-ZIM-domain）亚家族，包含TIFY、PPD和Modified jas结构域的PPD（PEAPOD）亚家族[2]。其中，JAZ是TIFY的4个亚家族中成员数最多的亚家族[3]，不含DNA结合结构域，必须通过与其他蛋白相互作用进而发挥其功能，其JAS结构域可通过与MYC2蛋白互作而参与到JA信号传导途径，还可与MYB、EIN3和EIL1等转录因子互作，从而调控植物的应激反应和次生代谢物质的合成[4-5]。
自首次在拟南中发现TIFY基因（At4g24470）以来[6]，多种植物TIFY基因被鉴定出来，研究者对其生物学功能也有了更深入的了解。研究发现，TIFY在调控植物花序发育与开花时间[6]、种子萌发[7]、根系生长[8]、块茎形成和膨大[9]、表皮毛形成[4]、花器官发育[10]、叶片衰老[11]、花青素积累[4]、响应生物[12]和非生物胁迫（干旱胁迫、渗透胁迫和盐胁迫）过程中均发挥重要作用。TIFY家族中JAZ亚家族成员为茉莉酸途径的抑制因子，通过与多种转录因子和共阻遏蛋白结合，可将茉莉酸途径和其他多种植物激素信号转导通路联系起来，进而调控植物的生长发育、胁迫响应和激素应答[3]。此外，TIFY还参与植物器官大小的调控。过表达水稻OsTIFY11b的转基因水稻籽粒长度、宽度和厚度较非转化植株显著增加[13]。菊花TIFY家族蛋白CmJAZ1-like通过与bHLH转录因子CmBPE2互作，抑制其对扩张蛋白CmEXPA7的促进作用，负调控菊花花瓣的大小[14]。小果蓝莓幼果中VcTIFY9s和VcTIFY10As的表达水平显著高于大果蓝莓，表明其可能参与蓝莓果实大小和发育的调控[15]。拟南芥AtTIFY4a（PPD1）和AtTIFY4b（PPD2）参与调控叶片的大小[16]。
丝瓜（2n=2x=26）为葫芦科丝瓜属重要的蔬菜作物，具有较高的营养价值、药用价值和工业价值。果实长度是丝瓜的重要外观品质，影响果实的大小和产量，其调控机制获得了研究者的广泛关注[17]。研究表明TIFY参与调控果实的发育和大小，但丝瓜中鲜见有该基因的研究报道。丝瓜参考基因组的公布为挖掘TIFY基因奠定了基础。因此，本研究在全基因组水平对丝瓜TIFY基因家族成员进行鉴定，基于转录组分析筛选出在果实中高表达的TIFY基因，并对其进行克隆和组织表达分析，研究结果为解析TIFY基因功能和丝瓜果实生长和发育的分子调控机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试植物材料为本实验室保存的肉丝瓜种质‘S’，种植于金陵科技学院园艺实验站，常规栽培管理。于盛果期取叶片、茎、卷须、雄花蕾、雌花（花蕾和子房分开取样）、果实（果皮、果肉和种子分开取样），液氮速冻后置于-80℃冰箱中保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 TIFY基因家族成员鉴定与蛋白理化性质分析
丝瓜‘P93075’基因组（v1.0）数据由CuGenDBv2（http://cucurbitgenomics.org/v2/）数据库下载，通过Pfam（http://pfam.xfam.org/）数据库下载TIFY的隐马尔可夫（HMM）模型PF06200，用Tbtools软件[18]的Simple HMM Search功能获取候选丝瓜TIFY基因；此外，由TAIR网站（https://arabidopsis.org/）下载拟南芥TIFY基因家族成员的核苷酸序列，在丝瓜基因组中执行本地BlastN（E=10-5）[19]，获得候选丝瓜TIFY基因。将上述候选基因在Pfam和SMART数据库中（http://smart.embl-heidelberg.de）进一步确认有无结构域，去除不含TIFY结构域的序列，获得最终序列，根据其在丝瓜染色体上的位置进行命名。用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）预测和分析丝瓜TIFY蛋白的分子质量、等电点等理化性质。
1.2.2 染色体定位分析
根据丝瓜‘P93075’基因组注释文件确定TIFY基因的染色体位置信息，用TBtools软件[18]进行染色体定位作图和基因结构可视化作图。
1.2.3 基于转录组的TIFY基因表达分析
根据本实验室前期完成的2份不同果形丝瓜‘S’（商品成熟期果实长度约36.5 cm，直径约63.4 mm）和‘L’（商品成熟期果实长度约91.9 cm，直径约35.7 mm）商品成熟期果实的转录组数据（https://ngdc.cncb.ac.cn/，GSA编号：CRA013782），分析丝瓜TIFY基因在丝瓜果实中的表达，基因表达量以FPKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）值表示，使用SPSS 17.0软件进行显著性分析。
1.2.4 丝瓜RNA的提取及cDNA第一链合成
用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（诺唯赞生物科技股份有限公司）进行丝瓜不同组织中总RNA的提取，检测合格后使用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（诺唯赞）将800 ng总RNA反转录成第一链cDNA。
1.2.5 丝瓜TIFY基因克隆与序列分析
基于转录组分析获得丝瓜果实中表达量高的4个基因（LcTIFY2、LcTIFY7、LcTIFY11和LcTIFY13），根据‘P93075’基因组序列设计特异性引物（表1），以‘S’丝瓜果实cDNA为模板，用PrimerSTAR Max DNA Polymerase（Takara）进行PCR扩增，反应体系（50 μL）参照说明书，反应程序：98℃变性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸10 s，35个循环。将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，目的片段经回收后与pEASY®-Blunt克隆载体（北京全式金生物）连接，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行1代测序，获得目的基因序列。从TAIR网站下载拟南芥TIFY蛋白质序列，用MEGA5.05的ClustalW进行序列比对，邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，自展值（bootstrap）设为1 000次。
1.2.6 基于荧光定量PCR（qRT-PCR）的TIFY基因表达分析
用ChamQ®SYBR qPCR Master Mix（Low ROX Premixed）试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）在ABI7500荧光定量PCR仪上进行丝瓜TIFY基因的表达分析，体系和反应程序参见试剂盒说明书。以LcUBQ作为内参，引物序列见表1。用 方法进行相对定量分析。用SPSS 17.0软件进行显著性分析，用Excel绘图。
表1试验所用引物
Table1Primers used in the present study
2 结果与分析
2.1 丝瓜TIFY基因家族成员鉴定与蛋白理化性质分析
研究在丝瓜基因组中共鉴定出17个TIFY基因，根据其染色体定位分别命名为LcTIFY1-LcTIFY17，CDS序列全长为297~1 353 bp，编码98~450个氨基酸，蛋白分子质量为10.94~47.74 kD，理论等电点（pI）为5.02~10.57，不稳定指数为39.39~82.06，亲水性为（-0.899）~（-0.255），脂肪指数为57.53~85.16（表2）。LcTIFY基因家族所有成员均为亲水性、不稳定蛋白，LcTIFY6、LcTIFY9和LcTIFY14理论等电点在酸性范围，其余成员均在碱性范围。
2.2 丝瓜TIFY基因的染色体定位
17个TIFY基因在‘P93075’丝瓜染色体上的分布不均匀，1号染色体上有5个，5号染色体上有3个，6号和12号染色体上有2个，0，3，4，10，13号染色体上均有1个，而2，7，8，9，11号染色体上无LcTIFY分布（图1）。
2.3 丝瓜TIFY基因在果实中的表达分析
用转录组数据分析丝瓜TIFY基因在果实中的表达（表3）发现，LcTIFY2、LcTIFY7、LcTIFY11和LcTIFY13在短果丝瓜‘S’和长果丝瓜‘L’果实中的表达量显著高于其他成员，且在‘L’果实中的表达量显著高于‘S’，推测其可能参与了丝瓜果实的发育。因此，选取上述4个基因进行克隆和组织表达分析。
表2丝瓜TIFY家族成员信息
Table2The basic data of the TIFY family members in L. cylindrica
图1丝瓜TIFY基因在染色体上的分布
Fig.1The distribution of TIFY genes on chromosomes of L. cylindrica
表3丝瓜TIFY基因在果实中的表达模式
Table3The expression profiles of L. cylindrica TIFY gens in fruits
注：不同小写字母表示基因表达量在‘S’和‘L’丝瓜果实中存在显著差异（P＜0.05）。
Note: Different lowercase letters indicate significant differences of expression levels between ‘S’ and ‘L’ L. cylindrica at P＜0.05 level.
2.4 丝瓜TIFY基因克隆
PCR扩增获得LcTIFY2、LcTIFY7、LcTIFY11和LcTIFY13的目的条带（图2），构建载体并测序，分别获得全长684 bp、699 bp、567 bp和426 bp的序列，且与基因组参考序列一致，分别编码227，232，188，141个氨基酸；基因结构分析表明其分别具有3，5，6，2个外显子（图2，B）。
利用丝瓜和拟南芥的TIFY蛋白序列构建系统进化树，可将丝瓜17个TIFY蛋白分为JAZ、PPD、TIFY和ZML 4个亚家族，分别含有11，1，2，3个成员，研究克隆的4个在丝瓜果实高表达的TIFY基因均为JAZ亚家族成员（图3）。
图2丝瓜TIFY基因PCR扩增电泳图谱（A）及基因结构（B）
Fig.2The electrophoretic map of PCR amplification of L. cylindrica TIFY gens (A) and gene structures (B)
图3丝瓜（Lc）和拟南芥（At）TIFY系统进化树
Fig.3Phylogenetic tree for TIFY of L. cylindrica (Lc) and Arabidopsis thaliana (At)
2.5 丝瓜TIFY基因的组织表达分析
通过qRT-PCR方法检测LcTIFY2、LcTIFY7、LcTIFY11和LcTIFY13在丝瓜不同组织中的表达（图4），发现4个基因均在果皮中的表达量最高；LcTIFY2和LcTIFY11在果肉中的表达量显著高于叶片；LcTIFY2在果肉中也具有较高的表达量，显著高于叶片和子房；LcTIFY7和LcTIFY13在生殖器官（雄花蕾、雌花蕾、子房）显著高于营养器官（叶片、茎和卷须）；LcTIFY11在雌花蕾和子房中的表达量显著高于雄花蕾。因此，推测TIFY基因在丝瓜生殖生长和果实发育过程中发挥作用。
图4qRT-PCR分析TIFY基因在丝瓜不同组织中的表达
Fig.4Expression of TIFY genes in various tissues of L. cylindrica by qRT-PCR analysis
不同小写字母表示在P＜0.05水平存在显著差异。
Different lowercase letters above cloumns indicate significant differences at P＜0.05 level.
3 讨论
TIFY家族蛋白在植物中广泛分布，在植物生长发育和响应生物和非生物胁迫过程中具有重要作用[3]。目前已有许多植物的TIFY家族被鉴定，如拟南芥[1]、西瓜[20]、黄瓜[21]、甘蓝型油菜[22]、白菜[22]和甘蓝[22]基因组中分别有18，15，17，77，36，39个TIFY基因。本研究在丝瓜基因组中共鉴定出17个TIFY基因，与同为葫芦科的黄瓜数目相等。丝瓜TIFY家族成员氨基酸数目为98（LcTIFY15）~450（LcTIFY4），与西瓜（118~450 aa）[20]和黄瓜（80~324 aa）[21]中的研究结果基本一致。系统进化分析可将丝瓜17个TIFY蛋白分为JAZ、PPD、TIFY和ZML 4个亚家族，其中JAZ亚家族成员数目最多，为11个，与前人在其他物种中的研究结果[1，20-22]一致。上述结果表明TIFY家族在葫芦科作物进化过程中比较保守。
本研究基于转录组分析表明，LcTIFY2、LcTIFY7、LcTIFY11和LcTIFY13在丝瓜果实中的表达量显著高于其他成员，推测其可能在果实发育过程中具有重要功能。前人研究也发现TIFY基因广泛参与植物器官大小的调控，如拟南芥AtTIFY4a（PPD1）和AtTIFY4b（PPD1）参与叶片大小的调控[16]；过表达水稻OsTIFY11b基因增加了茎秆中碳水化合物的积累，进而提高种子的大小[13]；菊花TIFY家族蛋白CmJAZ1-like负调控菊花花瓣的大小[14]；StJAZ1-like在马铃薯块茎的形成和膨大过程中具有重要作用[9]。此外，本研究还发现上述4个基因在长果丝瓜‘L’果实中的表达量显著高于短果丝瓜‘S’。前人在蓝莓中的研究发现小果蓝莓幼果VcTIFY9s和VcTIFY10As表达水平显著高于大果蓝莓，推测其可能参与了蓝莓果实大小和发育的调控[15]。葡萄VvTIFY10A在长圆品种中的表达量显著高于椭圆形品种，而在近圆品种中的表达量最低，其在番茄中异源过表达导致转基因植株果实纵径增加8.17%，横径减小16.37%，推测该基因参与葡萄果形的调控[23]。因此，推测LcTIFY2、LcTIFY7、LcTIFY11和LcTIFY13基因可能参与了丝瓜果实发育和果形的调控。
对LcTIFY2、LcTIFY7、LcTIFY11和LcTIFY13基因进行克隆、测序和序列分析，结果表明其均为JAZ亚家族成员，分别具有2，4，5，1个内含子，与黄瓜TIFY基因具有1~9个内含子的研究结果[21]一致，表明丝瓜TIFY家族成员的基因结构多样性。为了进一步明确上述基因在丝瓜不同组织中的表达特性，本研究通过qRT-PCR分析了其在丝瓜9个组织中的表达，发现4个基因均在丝瓜果皮中的表达量最高，推测其可能通过参与调控果皮细胞的分裂和生长进而参与丝瓜果实的发育。据报道，TIFY家族中的JAZ蛋白可与多种转录因子及共阻遏蛋白结合，将茉莉酸和信号通路和其他植物激素信号通路联系起来，进而调节植物的生长发育[24]。棉花中GhJAZ3与GhSLR1的相互作用介导了茉莉酸和赤霉素对表皮细胞分化与伸长的调控[25]。本研究还发现LcTIFY7和LcTIFY13在雄花蕾、雌花蕾和子房中的表达量显著高于营养器官，而LcTIFY11在雌花蕾和子房中的表达量显著高于雄花蕾，表明上述基因可能在丝瓜的雌、雄生殖器官发育过程中具有特异性功能。前人研究也发现TIFY家族成员参与植物花器官的发育，如拟南芥AtTIFY1（ZIM）在花和花蕾中高表达[6]，参与花序的发育和开花的调控[26]；异源过表达甘蔗ScJAZ2使转基因拟南芥提早开花[27]。植物开花过程和花器官大小受细胞增殖和细胞生长共同决定，Guan等[28]研究了蝴蝶兰13个TIFY基因的表达，发现其中8个基因在蕾期具有较高的表达量，花开放后表达量逐渐降低，其可能通过调控花蕾中细胞的生长而促进花开放。因此推测LcTIFY7和LcTIFY13可能参与丝瓜花的开放过程。
4 结论
（1）普通丝瓜基因组中包含17个TIFY基因，可以分为4个亚家族，在染色体上的分布不均匀。
（2）基于转录组的表达分析发现LcTIFY2、LcTIFY7、LcTIFY11和LcTIFY13在丝瓜果实中的表达量显著高于其他成员，对其进行克隆和测序发现分别具有3，5，6，2个外显子，均属于JAZ亚家族。
（3）基于荧光定量的组织表达分析发现LcTIFY2、LcTIFY7、LcTIFY11和LcTIFY13均在丝瓜果皮中的表达量最高；此外，LcTIFY7和LcTIFY13在生殖器官中的表达量显著高于营养器官；LcTIFY11在雌花蕾和子房中的表达量显著高于雄花蕾。
