纳米氧化锌预处理对盐碱胁迫下枸杞幼苗生理响应的影响
doi: 10.7606/j.issn.1000-4025.20240372
张荣荣1 ， 王延智2 ， 王子婷3 ， 张宝琳3
1. 白银市林业和草原局，甘肃白银 730900
2. 甘肃恒泰泽生物科技有限公司，甘肃白银 730900
3. 甘肃省林业科学研究院，兰州 730020
基金项目: 甘肃省重点研发计划项目“陇中黄土区黑果枸杞引种及栽培利用研究”(20YF3FA010)
Effects of zinc oxide nanoparticles pretreatment on physiological response of Lycium barbarum seedlings under salt and alkali stress
ZHANG Rongrong1 ， WANG Yanzhi2 ， WANG Ziting3 ， ZHANG Baolin3
1. Baiyin Forestry and Grassland Bureau, Baiyin, Gansu 730900 , China
2. Gansu Hengtaize Biotechnology Co., Ltd. Baiyin, Gansu 730900 , China
3. Gansu Academy of Forestry Sciences, Lanzhou 730020 , China
摘要
【目的】 研究纳米氧化锌(ZnO NPs)对盐碱胁迫下枸杞幼苗的生理效应，评估其缓解盐碱胁迫的生理机制及其应用潜力、适宜浓度。【方法】用1年生‘宁杞10号’枸杞盆栽幼苗为材料，先根部浇灌不同浓度(50，100，150 mg/L)ZnO NPs悬浮液，再进行100 mmol/L盐碱胁迫处理，在胁迫15 d和30 d取样测定幼苗生物量，光合色素、渗透调节物质、Na+、K+、活性氧(ROS)含量和抗氧化酶活性，以及AsA-GSH循环相关指标等，并综合评价处理效应。【结果】ZnO NPs预处理可以显著促进盐碱胁迫下枸杞幼苗生物量积累，增加叶片叶绿素含量，提高AsA-GSH循环抗氧化物质含量和相关酶活性以及SOD、POD、CAT活性，显著降低细胞膜损伤和脂质过氧化程度，显著提高可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白积累和调节Na+/K+平衡，并以100 mg/L ZnO NPs处理的缓解效果最佳。【结论】根施ZnO NPs通过促进叶绿素积累，调控AsA-GSH循环和抗氧化酶活性高效清除过量ROS，提高渗透调节能力及维持Na+/K+平衡，有效减轻盐碱胁迫对枸杞幼苗的生长抑制。
Abstract
[Objective] The study aims to investigate the effects of zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) on the ‘Ningqi No. 10’ wolfberry seedlings under saline-alkali stress, evaluate its physiological mechanism for alleviating saline-alkali stress, and explore its application potential and suitable concentrations. [Methods] One-year-old ‘Ningqi No. 10’ wolfberry seedlings in pots were used as materials. The roots were irrigated with ZnO NPs solutions of different concentrations (50, 100, and 150 mg/L), followed by 100 mmol/L saline-alkali stress treatment. Samples were collected after 15 and 30 days of stress treatments to measure seedling biomass, photosynthetic pigments, osmoregulatory substances, Na+, K+, and reactive oxygen species (ROS) content, antioxidant enzyme activity, and AsA-GSH cycle-related indicators. A comprehensive evaluation of the treatments was conducted. [Results] ZnO NPs pretreatment significantly promoted the accumulation of biomass in wolfberry seedlings under saline-alkali stress, increased leaf chlorophyll content, enhanced the content of antioxidant substances and related enzyme activities in the AsA-GSH cycle, as well as SOD, POD, and CAT activities. It significantly reduced cell membrane damage and lipid peroxidation, significantly increased the accumulation of soluble sugar, proline, and soluble protein, and regulated the Na+/K+ balance. Among the tested concentrations, 100 mg/L ZnO NPs treatment showed the best mitigation effect. [Conclusion] Root application of ZnO NPs effectively alleviates the growth inhibition of wolfberry seedlings under saline-alkali stress by promoting chlorophyll accumulation, regulating the AsA-GSH cycle and antioxidant enzyme activity to efficiently scavenge excessive ROS, enhancing osmotic adjustment capacity, and maintaining Na+/K+ balance.
土壤盐碱化是一个全球性的环境问题，是农业可持续发展的重大障碍[1]。截至2021年，世界范围内盐碱地的总面积大约是9.54亿hm2，而中国的盐碱地则占据了约9 913万hm2，尤其是在中国干旱和半干旱地区土壤次生盐碱化情况由于化肥农药滥用正在进一步恶化[2]。盐碱胁迫会对植物产生渗透胁迫、氧化胁迫、离子毒害等危害，从而限制植物的正常生长发育[3]。枸杞（Lycium barbarum）是中国西北地区重要的经济药用作物，而西北农业生产地区面临着严重的土壤盐碱化问题，这对枸杞的生长发育产生了不利影响[4]。因此，探究提高枸杞耐盐碱性的措施对枸杞产业的可持续发展具有重要意义。
近年来，纳米材料由于其独特的空间结构、激素效应和抗菌特性在农业生产领域得到了越来越多的应用[5]。氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）已被证明能通过增强种子萌发、幼苗生长和干物质积累促进植物的生长发育[6]，且在植物应对非生物胁迫中也起着至关重要的缓解作用[7]。在盐分胁迫下，叶面喷施50 mg/L ZnO NPs可以促进蚕豆幼苗生物量积累以及叶绿素、次生代谢产物的合成，从而提高蚕豆幼苗的耐盐性[8]；适当浓度的ZnO NPs可以通过诱导渗透调节物质的合成提高茄子幼苗的耐盐性[9]。在水分胁迫下，ZnO NPs可以通过增强香菜幼苗的抗氧化酶活性促进其对水分胁迫的耐受性[10]。ZnO NPs还可以通过缓解芥菜体内MDA和H2O2的过度积累增强其砷耐受性[11]。目前，虽然ZnO NPs在非木本植物响应逆境胁迫方面已有不少重要研究，并有ZnO NPs应用于增强非木本植物抗逆性的研究报道，但其在木本植物，特别是经济药用作物（如枸杞）中的具体应用及其作用机制仍需进一步深入探索。
‘宁杞10号’具有生长快、结果早、自交亲和力强、抗逆性强、产量高的特点，已在中国西北地区广泛栽培，是目前枸杞产业中常用的优质品种[12]。因此，本试验以1年生‘宁杞10号’幼苗为材料，探讨了盐碱胁迫下根部预施不同浓度ZnO NPs溶液对其生理特性的影响，并采用主成分分析法筛选出最适ZnO NPs浓度，为在田间栽培中应用ZnO NPs增强枸杞盐碱抗性提供理论指导。
1 材料和方法
1.1 试验材料
纳米氧化锌（ZnO NPs，粒径：30~80 nm，纯度：99%）由江苏先丰纳米材料科技有限公司提供。制备ZnO NPs悬浮液的方法：先将ZnO NPs粉末与蒸馏水混合，使用磁力搅拌器在室温下搅拌30 min以分散粉末；再超声处理30 min进一步破碎团聚体，确保纳米颗粒均匀分布；最后离心去除杂质，获得纯净的ZnO NPs悬浮液。1年生‘宁杞10号’幼苗购自宁夏祥瑞丰农业发展有限公司。
1.2 试验处理
2023年4月将购买的1年生‘宁杞10号’幼苗置于甘肃恒泰泽生物科技有限公司实验室统一管理，待缓苗10 d后，栽植至陶瓷花盆（口径25 cm，深38 cm）中，其中基质（3.5 kg）由质量分数为20%蛭石、20%珍珠岩和60%泥炭土组成，每盆1株，移至甘肃恒泰泽生物科技有限公司实验棚进行培养。幼苗培养1周后，随机选择225株无病虫害、长势均匀的幼苗，将制备好的ZnO NPs悬浮液均匀浇灌在‘宁杞10号’幼苗根部基质表层，于处理后30 d进行盐碱胁迫。
试验共设CK（正常生长）、SA（100 mmol/L盐碱溶液胁迫，nNaCl∶nNaHCO3=1∶1）、SZn50（SA+50 mg/L ZnO NPs）、SZn100（SA+100 mg/L ZnO NPs）和SZn150（SA+150 mg/L ZnO NPs）5个处理，每个处理15株，3次重复。其中，CK始终浇Hoangland营养液；在ZnO NPs预处理阶段，除CK和SA处理外，SZn50、SZn100、SZn150处理均在基质表层浇200 mL相应浓度的ZnO NPs悬浮液，共浇5次；在盐碱胁迫阶段，除CK外，SA、SZn50、SZn100、SZn150处理均浇200 mL盐碱溶液，共浇3次，3次盐碱溶液处理后基质的pH为8.2，已达到盐碱胁迫条件。于盐碱胁迫0 d（2023年6月13日上午7:00）进行首次取样，后续每隔15 d采集样本进行后续指标测定，共采样3次。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 生物量
在盐碱胁迫第30天，随机选取每个处理的3株幼苗，将幼苗分为地上部分（茎和叶）和根系部分。然后将各种样品置于70℃的烘箱中烘干至恒重，再分别称取干重。
1.3.2 生理指标
在盐碱胁迫第0，15，30 天时，随机采取每个处理幼苗新梢的中上部叶片，用蒸馏水清洗擦试干净，去除叶脉后磨碎，用于测定生理指标。叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）含量均用丙酮萃取法[13]测定；可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）、脯氨酸（Pro）含量分别采用3，5-二硝基水杨酸法[14]、考马斯亮蓝法[15]、酸性茚三酮法[16]测定；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性分别采用氮蓝四唑光化还原法[17]、愈创木酚法[18]和紫外吸收法[19]测定；相对电导率（REC）和丙二醛（MDA）含量分别采用电导仪法[20]和硫代巴比妥酸法[21]测定；过氧化氢（H2O2）含量、超氧阴离子产生速率（O2·¯）、还原型谷胱甘肽（GSH）含量、还原型抗坏血酸（AsA）含量、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性和谷胱甘肽还原酶（GR）活性均采用试剂盒法（索莱宝生物科技有限公司，北京）测定。Na+和K+含量使用火焰光度法测定，具体参考Kamble等[22]的方法：将叶片干燥并研磨，准确称取5 g叶粉干样品，用H2SO4-H2O2进行消煮，然后用火焰光度计测定Na+和K+含量。
1.4 数据分析
用Excel 2020整理数据，用软件SPSS 22.0（IBM，Armonk，NY，USA）对数据进行显著性检验、相关性检验和主成分分析。用软件Origin 2020作图，采用单因素ANOVA的Duncan法进行多重比较，差异显著水平为0.05。
2 结果与分析
2.1 ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’幼苗生物量的影响
盐碱胁迫（SA）处理30 d时，‘宁杞10号’幼苗的地上部干重和根干重较正常生长对照（CK）分别显著下降36.09%和39.38%（图1）。不同浓度ZnO NPs预处理再进行盐碱胁迫后，幼苗地上部和根干重均较SA处理显著提高，并以SZn100处理升幅最大，分别较SA处理提高39.79%和45.57%，但各浓度ZnO NPs预处理幼苗地上部和根干重仍显著低于CK。说明ZnO NPs预处理能够显著促进盐碱胁迫下‘宁杞10号’幼苗生长，有效减轻盐碱胁迫的伤害。
图1ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗单株生物量的影响
Fig.1Effects of ZnO NPs pretreatment on the individual plant biomass of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
CK为正常生长对照，SA为100 mmol/L盐碱胁迫处理（nNaCl∶nNaHCO3=1∶1），SZn50、SZn100和SZn150分别为 50，100，150 mg/L ZnO NPs预处理后再进行盐碱胁迫处理。不同小写字母表示同期处理间在0.05水平存在显著性差异。下同。
CK represents the normal growth control, SA represents the treatment of 100 mmol/L saline-alkali stress (nNaCl∶nNaHCO3=1∶1) , and SZn50, SZn100, and SZn150 represent the pretreatments with 50, 100, and 150 mg/L ZnO NPs before the saline-alkali stress treatment, respectively. Different lowercase letters indicate significant differences among treatments at the 0.05 level for the same period. The same as below.
2.2 ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’幼苗叶片叶绿素含量的影响
图2表明，与对照（CK）相比，各处理‘宁杞10号’幼苗叶片叶绿素a、叶绿素 b和叶绿素（a+b）含量在盐碱胁迫处理前（0 d）除SZn150外均无显著差异，在盐胁迫15 d 和30 d均显著下降，且胁迫时间越长降幅越大；与SA处理相比，不同浓度ZnO NPs处理叶绿素含量均不同程度增加，且增幅大多达到显著水平，但仍均显著低于同期CK；在各浓度ZnO NPs处理间相比，SZn100处理叶片叶绿素a、叶绿素b和叶绿素（a+b）含量显著高于同期SZn150和SZn50处理，在盐碱胁迫30 d时分别是SA处理的1.28，1.33，1.29倍。可见，根施ZnO NPs能显著促进盐碱胁迫下‘宁杞10号’幼苗叶片叶绿素积累，特别是100 mg/L浓度处理效果更优，从而增强叶片光合能力。
图2ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗叶片叶绿素含量的影响
Fig.2Effects of ZnO NPs pretreatment on chlorophyll content in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
2.3 ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’幼苗叶片渗透调节物质含量的影响
各处理‘宁杞10号’幼苗叶片脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量随盐碱胁迫持续均呈上升趋势（图3）。与CK相比，各处理幼苗叶片脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量在盐碱胁迫前均无显著差异，在盐碱胁迫15 d和30 d显著升高，且处理时间越长增幅越大；与SA处理相比，不同浓度ZnO NPs处理叶片脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均显著提高，并均以SZn100处理最高，SZn150处理次之，SZn50处理最低，且各浓度处理间差异显著。其中，在盐碱胁迫30 d时，SZn100处理叶片的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量分别为SA的1.32，1.29，2.03倍。可见，‘宁杞10号’幼苗叶片渗透调节物质含量在盐碱胁迫下显著提高，并在各浓度ZnO NPs预处理后进一步显著增加，且100 mg/L浓度处理效果更优。
图3ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗叶片渗透调节物质含量的影响
Fig.3Effects of ZnO NPs pretreatment on the content of osmotic adjustment substances in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
2.4 ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’幼苗叶片膜透性、抗氧化酶活性和活性氧含量的影响
2.4.1 REC和MDA含量
如图4所示，盐碱胁迫（SA）处理‘宁杞10号’幼苗叶片相对电导率（REC）和MDA含量均较同期CK显著升高，并且随胁迫时间持续而增加；不同浓度ZnO NPs处理叶片REC和MDA含量均较SA处理显著下降，并均以SZn100处理最低，且多与同期SZn150和SZn50处理差异显著，但仍显著高于同期CK。在胁迫30 d时，SZn100处理叶片REC和MDA含量分别较SA处理显著降低37.07%和24.81%。
2.4.2 抗氧化酶活性
‘宁杞10号’幼苗叶片SOD、POD和CAT活性在盐碱胁迫处理（SA）30 d和15 d时均较同期CK显著升高（图5），且胁迫30 d又高于胁迫15 d。与SA处理相比，各时期不同浓度ZnO NPs处理叶片SOD、POD和CAT活性均显著升高，且有随浓度升高而先升后降的趋势，并均以SZn100处理最高，且与同期其余浓度处理差异显著。在胁迫至30 d时，SZn150处理叶片SOD、POD和CAT活性分别较SA处理显著升高34.43%、47.30%和20.75%。
图4ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗叶片REC和MDA含量的影响
Fig.4Effects of ZnO NPs pretreatment on REC and MDA contents in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
图5ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗叶片抗氧化酶活性的影响
Fig.5Effects of ZnO NPs pretreatment on antioxidant enzyme activities in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
2.4.3 ROS含量
由图6可知，在盐碱胁迫15 d和30 d时，各处理‘宁杞10号’幼苗叶片H2O2含量和O2·¯产生速率均较同期CK处理显著升高，并均以CK升幅最大，在15 d时分别为56.07%和54.55%，在30 d时分别为84.29%和118.18%；不同浓度ZnO NPs处理叶片H2O2含量和O2·¯产生速率均较同期SA处理显著下降，并整体上以SZn100处理最低，而以SZn50处理最高且显著高于同期其余浓度处理。在盐碱胁迫30 d时，SZn100处理叶片H2O2含量和 O2·¯产生速率分别比SA处理显著降低18.21%和33.33%。可见，100 mg/L ZnO NPs预处理能够有效地抑制盐碱胁迫引起的活性氧积累，从而减轻氧化应激对幼苗的伤害。
图6ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗叶片ROS含量的影响
Fig.6Effects of ZnO NPs pre-treatment on ROS content in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
2.5 ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’幼苗叶片离子含量的影响
‘宁杞10号’幼苗叶片的Na+含量和Na+/K+随盐碱胁迫时间延长表现出升高的趋势，而叶片K+含量呈下降的趋势（图7）。在盐碱胁迫15 d和30 d时，各处理幼苗叶片的Na+含量和Na+/K+均比同期CK显著大幅升高，而其K+含量均比同期CK显著大幅降低；不同浓度ZnO NPs处理Na+含量和Na+/K+均较同期SA处理显著降低，并以SZn100处理降幅最大，而它们K+含量均比同期CK显著升高，并以SZn150处理升幅最大，且升降幅度与其余2种浓度处理均差异显著。其中，盐碱胁迫至30 d时，SZn100处理叶片的Na+含量和Na+/K+较SA分别降低42.79%和61.45%，而SZn150处理的K+含量较SA处理显著升高20.46%。可见，ZnO NPs预处理能够有效地缓解盐碱胁迫对幼苗离子稳态的影响，减少Na+的积累并维持K+的稳定，且100 mg/L浓度处理效果更优。
2.6 ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’幼苗叶片AsA-GSH循环的影响
‘宁杞10号’幼苗叶片的APX和GR活性随着盐碱胁迫时间延长表现出升高趋势，而其AsA和GSH含量呈现下降的趋势（图8）。
在盐碱胁迫15 d和30 d时，各处理幼苗叶片的APX和GR活性均比CK显著升高，其AsA、GSH含量整体上比CK显著降低；不同浓度ZnO NPs处理幼苗叶片APX、GR活性和AsA、GSH含量均较同期SA处理显著升高，并均以SZn100处理增幅最大，并显著高于同期其余处理。其中，在胁迫至30 d时，SZn100处理叶片的APX活性、GR活性、AsA含量和GSH含量较SA处理分别显著升高37.33%、33.98%、59.12%和91.30%。可见，各浓度ZnO NPs预处理均显著提高了盐碱胁迫下‘宁杞10号’幼苗叶片的APX和GR活性以及AsA和GSH含量，使其对盐碱胁迫的耐受性显著增强。
图7ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗叶片离子含量的影响
Fig.7Effects of ZnO NPs pre-treatment on ion content in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
图8ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’幼苗叶片AsA-GSH循环的影响
Fig.8Effects of ZnO NPs pre-treatment on AsA-GSH cycle in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
图9盐碱胁迫下不同浓度 ZnO NPs预处理‘宁杞10号’幼苗各项生理指标的相关系数
Fig.9Correlation coefficient among physiological indexes of ‘Ningqi No.10’ seedlings pre-treated by different concentrations of ZnO NPs under saline-alkali stress
2.7 盐碱胁迫下不同浓度 ZnO NPs对‘宁杞10号’幼苗生理效应的综合评价
2.7.1 相关性分析
对盐碱胁迫30 d后‘宁杞10号’幼苗叶片的21个指标进行相关性分析。结果（图9）表明，‘宁杞10号’幼苗叶片的21个指标之间关系密切，均呈现出显著或者极显著相关性，其中Chl a与Chl b、Chl（a+b）、K+、AsA、GSH、SDW和RDW呈极显著正相关（P＜0.01），与SOD、CAT、REC、MDA、Pro、SS、SP、 H2O2、O2·¯、APX和GR呈极显著负相关（P＜0.01），与POD呈显著负相关（P＜0.05）。
2.7.2 主成分分析
为全面评估不同浓度ZnO NPs预处理‘宁杞10号’幼苗对盐碱胁迫的生理响应特征，对21个生理指标进行了主成分分析（PCA），提取了2个特征值大于1的主成分，分别为14.581和5.607。第1和第2主成分方差贡献率分别为69.432%和26.699%，累计方差贡献率达到96.131%，满足分析要求（表1）。其中，PC1综合了Chl a、Chl b、Chl（a+b）、CAT、 REC、MDA、Pro、SS、H2O2、O2·¯、Na+、K+、APX、GR、GSH、SDW和RDW，而PC2综合了SOD、POD、SP和AsA（表1）。
表1主成分分析及方差解释
Table1Principal component analysis and variance interpretation
注：PC1、PC2分别代表主成分1和主成分2。下同。
Note: PC1 and PC2 represent principal component 1 and principal component 2, respectively. The same as below.
同时，进一步将每个主成分得分与相应方差贡献率的乘积相加计算得到综合得分（F = F1×69.432%+F2×26.699%），并依据F值对各处理进行综合排序。结果（表2）表明，各处理综合得分分别为0.186 04（SA）、0.313 68（SZn50）、0.528 96（SZn100）和0.390 72（SZn150）。因此，在盐碱胁迫下，不同浓度的ZnO NPs预处理对‘宁杞10号’幼苗生理特性影响的综合排名为：SZn100＞SZn150＞SZn50＞SA。这与‘宁杞10号’幼苗单株生物量的表现完全一致。
表2盐碱胁迫下不同浓度 ZnO NPs 预处理对‘宁杞10号’ 幼苗生理效应的综合得分及排名
Table2Comprehensive score and ranking of physiological effects of different concentrations of ZnO NPs pre-treatment on ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
3 讨论
植物生物量是评估植物生长状况的最直观指标[23]。盐胁迫通常会抑制植物根系的扩展以及茎叶的增长，导致生物量减少[24]。本研究结果表明，ZnO NPs预处理能够在盐碱胁迫条件下促进‘宁杞10号’幼苗根系的发育，进而提升其生物量，这可能是ZnO NPs在促进根系细胞壁的形成、增强IAA的合成与运输，以及改善根系对水分和营养物质吸收能力方面的作用，特别是提高植物吸收氮（N）、磷（P）等关键营养元素的能力，最终促进了根系生长和生物量的增长。叶绿素是植物光合作用的关键物质，能够吸收和转化光能[25]。盐碱胁迫促进植物叶片色素的分解，导致叶片老化和萎蔫，从而降低光合作用能力[26]。本研究发现，随着盐碱胁迫时间的延长，‘宁杞10号’幼苗叶片中的叶绿素a、叶绿素 b和总叶绿素含量呈下降趋势，这可能是盐碱胁迫引起叶片细胞内离子平衡紊乱，破坏了叶绿体结构和膜系统，影响叶绿素的合成和稳定性，从而影响叶绿素的含量和功能[27]。不同浓度的ZnO NPs处理后，‘宁杞10号’幼苗叶片中的叶绿素 a、叶绿素b和总叶绿素含量均较盐碱处理组有不同程度的升高，并以100 mg/L ZnO NPs处理升幅最大，这可能是因为ZnO NPs提供了植物生长所需的锌元素，增强其抗氧化能力，调节细胞代谢，并诱导植物的适应性反应，保护叶绿体免于老化，增加了光合色素的含量。这一发现与Rasouli等[28]在辣椒中的研究结果一致。
可溶性糖、可溶性蛋白质和脯氨酸可以通过增加植物体内的相对含水量和细胞质渗透压来增强细胞膜的稳定性，从而使其能够抵抗逆境胁迫[29]。李悦等[30]研究表明，随着盐碱浓度和胁迫天数的增加，元宝枫幼苗可溶性糖含量呈上升趋势，脯氨酸、可溶性蛋白含量等呈现先升后降的趋势。本研究结果表明，‘宁杞10号’幼苗叶片中脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量在盐碱胁迫下均显著增加，这可能是盐碱胁迫促使‘宁杞10号’幼苗积累脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白作为渗透调节剂以维持细胞水分平衡和保护细胞免受盐离子伤害。同时，不同浓度ZnO NPs处理后，‘宁杞10号’幼苗叶片中脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均进一步显著增加，这可能是ZnO NPs调节了脯氨酸合成酶、糖酵解酶和糖苷酶的活性，提供了抗氧化保护。此外，ZnO NPs还可能调节植物激素的平衡并增强细胞膜的稳定性，这些变化最终促进了渗透调节物质的合成和积累，使‘宁杞10号’幼苗能够更有效地抵抗盐碱胁迫。
细胞质膜的稳定结构和功能与植物的耐盐碱性紧密相关[31]。植物遭遇盐碱胁迫时，植物细胞膜系统会受到破坏，导致叶片电解质渗漏，相对电导率上升，还可能引起体内ROS的过度积累，从而产生膜脂过氧化反应，造成MDA含量增加，阻碍细胞的正常代谢[32]。王燕等[33]也发现，随着盐碱胁迫时间的增加，万寿菊叶片相对电导率和MDA含量也随之增加。因此，本研究中‘宁杞10号’幼苗叶片相对电导率和MDA含量均随盐碱胁迫时间的增加而持续显著升高，这可能是盐碱胁迫导致其叶片细胞膜损伤和氧化应激所致。同时，在不同浓度ZnO NPs预处理后，‘宁杞10号’幼苗叶片相对电导率和MDA含量均较盐碱胁迫（SA）处理呈现不同程度地下降，且存在浓度效应，这可能是ZnO NPs通过清除活性氧、调节激素平衡和增强光合作用，减轻了盐碱胁迫对叶片造成的细胞膜损伤和氧化应激损伤，这与何与晗等[34]在紫花苜蓿上相关的研究结果相似。
在植物遭遇逆境胁迫时，其自身的抗氧化酶系统会被启动，以清除过量的ROS（主要为H2O2和 O2·¯），这是保护细胞完整性、避免膜结构和蛋白质损伤乃至细胞死亡的关键过程[35]。POD、CAT和SOD等抗氧化酶在消除活性氧自由基以及保持活性氧代谢平衡方面起到了至关重要的作用[36]。Faizan等[37]研究表明，叶面喷施ZnO NPs可以显著增强番茄幼苗叶片抗氧化酶（SOD、POD、CAT和APX）活性，使得其耐盐碱性增加。本研究中，‘宁杞10号’幼苗在盐碱胁迫下，其叶片中SOD、POD和CAT活性随胁迫时间延长而显著升高。值得注意的是，ZnO NPs预处理进一步提升了SOD、POD和CAT的活性，暗示ZnO NPs可能作为诱导因子，促进了抗氧化酶（包括SOD、POD、CAT等）的合成，从而强化了植物的抗氧化防御体系。AsA-GSH 循环作为清除H2O2和O2·¯的主要途径，该循环中主要由APX、GR、AsA和GSH共同协作完成，从而修复自由基造成的损伤[38]。本研究发现，在盐碱胁迫条件下，‘宁杞10号’幼苗叶片中AsA和GSH含量显著下降，而ZnO NPs预处理，尤其是100 mg/L浓度处理显著提升了AsA和GSH含量，这可能是由于ZnO NPs促进了AsA向DHA的转化及GSH与GSSG之间的平衡交换，维持了叶片的氧化还原稳态，增强了其耐盐碱能力。进一步分析发现，APX和GR作为AsA-GSH循环的关键酶[39]，在盐碱胁迫下活性显著升高，ZnO NPs预处理则进一步增强了APX和GR活性。与此同时，ZnO NPs预处理下‘宁杞10号’叶片中H2O2含量、O2·¯产生速率、相对电导率和MDA含量均较SA处理不同程度下降。这可能是ZnO NPs提供的锌元素激活抗氧化信号通路，不仅直接增强抗氧化能力，还通过调节渗透物质含量保护细胞结构，间接促进APX和GR的活性，最终协同抗氧化酶系统共同减轻了盐碱胁迫诱导的氧化损伤。
在盐碱胁迫下，离子平衡对植物维持膜完整性至关重要[40]。有研究表明，盐碱胁迫下过量的Na+渗入植物细胞，导致体内离子失衡，从而导致细胞损伤并可能导致细胞死亡[41]。本研究发现，在盐碱胁迫条件下，‘宁杞10号’幼苗叶片的Na+含量显著增加，同时叶片中K+含量显著降低，而在ZnO NPs处理后叶片的Na+含量显著降低，K+含量显著增加，这与Mahawar等[42]在萝卜中的研究结果相似。这可能是因为ZnO NPs通过改变细胞膜的透性或激活特定的离子转运蛋白，从而促进了K+的吸收和Na+的排出，帮助植物恢复了离子平衡。
4 结论
外源预施加各浓度ZnO NPs均对盐碱胁迫下‘宁杞10号’幼苗的生长表现出显著促进作用，显著缓解了盐碱胁迫对‘宁杞10号’幼苗生长的抑制，且缓解效应以100 mg/L最强；100 mg/L ZnO NPs处理地上部干重和根干重分别较SA处理增加39.79%和45.57%。外源ZnO NPs灌根预处理可以通过提高盐胁迫下 ‘宁杞10号’幼苗的叶绿素含量、渗透调节物质含量，调控抗氧化酶活性和AsA-GSH循环，及时清除过量ROS和维持Na+/K+平衡等途径有效缓解过氧化伤害，增强幼苗的耐盐碱性，且以100 mg/L ZnO NPs处理效果最佳。
图1ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗单株生物量的影响
Fig.1Effects of ZnO NPs pretreatment on the individual plant biomass of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
图2ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗叶片叶绿素含量的影响
Fig.2Effects of ZnO NPs pretreatment on chlorophyll content in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
图3ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗叶片渗透调节物质含量的影响
Fig.3Effects of ZnO NPs pretreatment on the content of osmotic adjustment substances in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
图4ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗叶片REC和MDA含量的影响
Fig.4Effects of ZnO NPs pretreatment on REC and MDA contents in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
图5ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗叶片抗氧化酶活性的影响
Fig.5Effects of ZnO NPs pretreatment on antioxidant enzyme activities in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
图6ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗叶片ROS含量的影响
Fig.6Effects of ZnO NPs pre-treatment on ROS content in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
图7ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’ 幼苗叶片离子含量的影响
Fig.7Effects of ZnO NPs pre-treatment on ion content in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
图8ZnO NPs预处理对盐碱胁迫下‘宁杞10号’幼苗叶片AsA-GSH循环的影响
Fig.8Effects of ZnO NPs pre-treatment on AsA-GSH cycle in leaves of ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
图9盐碱胁迫下不同浓度 ZnO NPs预处理‘宁杞10号’幼苗各项生理指标的相关系数
Fig.9Correlation coefficient among physiological indexes of ‘Ningqi No.10’ seedlings pre-treated by different concentrations of ZnO NPs under saline-alkali stress
表1主成分分析及方差解释
Table1Principal component analysis and variance interpretation
表2盐碱胁迫下不同浓度 ZnO NPs 预处理对‘宁杞10号’ 幼苗生理效应的综合得分及排名
Table2Comprehensive score and ranking of physiological effects of different concentrations of ZnO NPs pre-treatment on ‘Ningqi No.10’ seedlings under saline-alkali stress
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